Un<em> Ex Vivo</em> Méthode pour imagerie time-lapse de Cultured Rat mésentériques microvasculaires Networks
Summary
Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.
Abstract
Angiogenèse, définie comme la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, implique des cellules endothéliales, péricytes, les cellules musculaires lisses, les cellules immunitaires, et la coordination avec les vaisseaux lymphatiques et les nerfs. Le multi-cellulaire, les interactions multi-système nécessite l'enquête de l'angiogenèse dans un environnement physiologiquement pertinents. Ainsi, alors que l'utilisation de modèles in vitro de cultures cellulaires ont fourni des indications mécanistes, une critique commune est qu'ils ne récapitulent la complexité associée à un réseau microvasculaire. L'objectif de ce protocole est de démontrer la capacité de faire des comparaisons time-lapse de réseaux microvasculaires intacts avant et après stimulation de l'angiogenèse dans les tissus mésentère de rat en culture. tissus de culture contiennent des réseaux microvasculaires qui maintiennent leur hiérarchie. marquage immunohistochimique confirme la présence de cellules endothéliales, cellules musculaires lisses et les pericytes, les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques. Dans unddition, marquage de tissus avec une lectine BSI permet de comparer le temps écoulé des régions du réseau local avant et après la stimulation du facteur de croissance ou du sérum, caractérisé par une augmentation de la germination et de la densité capillaire du récipient. En comparaison avec les modèles de culture cellulaire communs, cette méthode fournit un outil pour les études endothéliales de la lignée cellulaire et évaluation du médicament angiogénique spécifique de tissu dans les réseaux microvasculaires physiologiquement pertinents.
Introduction
La croissance du réseau microvasculaire et le remodelage des dénominateurs communs pour la fonction des tissus, la cicatrisation des plaies, et de multiples pathologies et un processus clé est l' angiogenèse, définie comme la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de ceux qui existent déjà 1, 2. Pour les tissus d'ingénierie de nouveaux navires ou la conception de thérapies angiogéniques, la compréhension de l'importance de la dynamique cellulaires impliqués dans l'angiogenèse est critique. Cependant, ce procédé est complexe. Elle peut varier à des emplacements spécifiques à l' intérieur d' un réseau microvasculaire et implique plusieurs types de cellules ( par exemple les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, des pericytes, des macrophages, des cellules souches) et plusieurs systèmes (réseaux lymphatiques et des réseaux de neurones). Bien que les modèles in vitro ont contribué énormément à l' examen de la relation entre les différentes cellules impliquées dans l' angiogenèse 3, leur pertinence physiologique peut être compromise en raison de Thei r complexité limitée et le fait qu'ils ne reflètent pas étroitement un scénario in vivo. Pour surmonter ces limitations, les systèmes de culture en trois dimensions 3 modèles de tissus, ex vivo 4, les systèmes microfluidiques 5, 6 et 7 modèles de calcul ont été élaborés et mis en place au cours des dernières années. Cependant, il existe encore un besoin d'un modèle avec une capacité time-lapse pour étudier l' angiogenèse dans les réseaux microvasculaires intacts ex vivo. La mise en place de nouveaux modèles time-lapse pour les études de l'angiogenèse avec ce niveau de complexité fournira un outil précieux pour comprendre les mécanismes sous-jacents qui régissent l'angiogenèse et d'améliorer les thérapies.
Un modèle de potentiel qui permet à l'étude ex vivo de l' angiogenèse à travers un réseau microvasculaire intacte est le mésentère modèle de culture de rat> 8. Dans des travaux récents, nous avons démontré que le sang et les réseaux microvasculaires lymphatiques restent viables après culture. Plus important encore, le mésentère modèle de culture de rat peut être utilisé pour étudier les interactions fonctionnelles de péricytes-endothélial cellulaires, le sang et les connexions des cellules endothéliales lymphatiques et imagerie time-lapse. L'objectif de ce document est de fournir notre protocole pour la méthode d'imagerie time-lapse. Nos résultats représentatifs de documenter les multiples types de cellules qui demeurent viables après la stimulation de l'angiogenèse avec du sérum et offrent des exemples d'utilisation de cette méthode pour quantifier les réponses angiogéniques spécifiques de tissus ainsi que des études de suivi des cellules endothéliales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole documente une méthode pour utiliser le modèle de culture de mésentère de rat comme un ex vivo outil pour imagerie time-lapse de la croissance du réseau microvasculaire. Des travaux antérieurs dans notre laboratoire a établi l'utilisation de notre modèle pour 1) l' angiogenèse 8, 2) lymphangiogenèse 8, 3) les interactions cellulaires péricytes-endothélial 8, et 4) le dépistage des drogues anti-angiogénique …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.
Materials
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12”x12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4"x4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5ml | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/ml |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/ml |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
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