Un<em> Ex Vivo</em> Método para time-lapse de rata cultivadas mesentéricas microvasculares Redes
Summary
Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.
Abstract
La angiogénesis, definida como el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes, implica células endoteliales, pericitos, células de músculo liso, células inmunes, y la coordinación con los vasos linfáticos y nervios. El multi-celda, las interacciones de múltiples sistemas requieren la investigación de la angiogénesis en un entorno fisiológicamente relevante. Por lo tanto, mientras que el uso de los modelos de cultivo celular in vitro han proporcionado ideas mecanicistas, una crítica frecuente es que no se recapitulan la complejidad asociada con una red microvascular. El objetivo de este protocolo es demostrar la capacidad de hacer comparaciones con lapso de tiempo de redes microvasculares intactas antes y después de la estimulación de la angiogénesis en los tejidos mesenterio de rata. tejidos cultivados contienen redes microvasculares que mantienen su jerarquía. marcaje inmunohistoquímico confirma la presencia de células endoteliales, células de músculo liso, pericitos, vasos sanguíneos y los vasos linfáticos. En unddition, el etiquetado de los tejidos con BSI-lectina permite la comparación de lapso de tiempo de las regiones locales de la red antes y después de la estimulación con suero o factor de crecimiento caracterizado por el aumento de la brotación y la densidad de los vasos capilares. En comparación con los modelos de cultivo celular comunes, este método proporciona una herramienta para estudios de linaje de células endoteliales y la evaluación de medicamentos angiogénico específico de tejido en las redes microvasculares fisiológicamente relevantes.
Introduction
Crecimiento de la red microvascular y la remodelación son denominadores comunes para la función del tejido, cicatrización de heridas, y múltiples patologías y un proceso clave es la angiogénesis, que se define como el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de los ya existentes 1, 2. Para la ingeniería de tejidos nuevos vasos o el diseño de terapias basadas angiogénicos, la comprensión de la importancia de la dinámica celulares implicados en la angiogénesis es crítica. Sin embargo, este proceso es complejo. Puede variar en lugares específicos dentro de una red microvascular y consiste en múltiples tipos de células (es decir, células endoteliales, células de músculo liso, pericitos, macrófagos, células madre) y sistemas múltiples (redes linfáticas y redes neuronales). Aunque los modelos in vitro han contribuido enormemente a examinar la relación entre las diferentes células implicadas en la angiogénesis 3, su relevancia fisiológica puede ser socavado debido a thei r complejidad limitada y el hecho de que no reflejan estrechamente un escenario en vivo. Para superar estas limitaciones, los sistemas de cultivo tridimensional 3, ex vivo modelos tisulares 4, los sistemas de microfluidos 5, 6, 7 y modelos computacionales se han desarrollado e introducido en los últimos años. Sin embargo, todavía hay una necesidad de un modelo con capacidad de lapso de tiempo para investigar la angiogénesis en las redes microvasculares intactas ex vivo. El establecimiento de nuevos modelos de lapso de tiempo para los estudios de la angiogénesis con ese nivel de complejidad proporcionará una herramienta muy valiosa para comprender los mecanismos subyacentes que regulan la angiogénesis y para mejorar las terapias.
Un posible modelo que permite la investigación ex vivo de la angiogénesis a través de una red microvascular intacto es el modelo de cultivo de mesenterio de rata> 8. En un trabajo reciente, hemos demostrado que las redes microvasculares linfáticos sangre y permanecen viables después del cultivo. Más importante aún, el modelo de cultivo de mesenterio de rata se puede utilizar para investigar las interacciones funcionales de pericitos células endoteliales, la sangre y las conexiones de las células endoteliales linfáticas, y time-lapse. El objetivo de este trabajo es proporcionar a nuestro protocolo para el método de imagen de lapso de tiempo. Nuestros resultados representativos documentan los múltiples tipos de células que se mantienen viables después de la estimulación de la angiogénesis con suero y ofrecen ejemplos del uso de este método para la cuantificación de las respuestas angiogénicas específicos de tejido, así como estudios de seguimiento de células endoteliales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo se documenta un método para utilizar el modelo de cultivo de mesenterio de rata como una herramienta ex vivo para time-lapse de crecimiento de la red microvascular. El trabajo previo en nuestro laboratorio ha establecido el uso de nuestro modelo para 1) la angiogénesis 8, 2) linfagiogénesis 8, 3) la interacción de células endoteliales de pericitos-8, y 4) las pruebas de drogas anti-angiogénico 9.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.
Materials
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12”x12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4"x4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5ml | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/ml |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/ml |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
References
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