この研究では、ゼブラフィッシュで急性および慢性の高血糖モデルを確立する方法について説明します。この目的は、構成的および傷害誘発性の神経発生のような生理学的過程に対する高血糖の影響を調べることである。この研究では、PET / CTを用いて放射標識分子（ここでは、[ 18 F] -FDG）を追跡するためのゼブラフィッシュの使用法が強調されています。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
ゼブラフィッシュにおける高血糖症の急性および慢性モデル：高血糖が神経新生および放射性標識分子の生体内分布に及ぼす影響を評価する方法
この記事について
サマリー
要約
高血糖は、心血管および大脳の機能不全をもたらす主要な健康問題である。例えば、脳卒中後の神経学的問題の増加に関連し、神経原性プロセスを損なうことが示されている。興味深いことに、成体ゼブラフィッシュは、高血糖症/糖尿病を模倣し、構成的および再生的な新形成を調べるために、関連性のある有用なモデルとして最近出現した。この研究は、恒常性および脳修復条件下での脳細胞増殖に対する高血糖の影響を調べるために、高血糖のゼブラフィッシュモデルを開発する方法を提供する。急性高血糖は、成人ゼブラフィッシュにD-グルコース（2.5g / kg体重）を腹腔内注射することにより確立される。慢性の高血糖は、成体ゼブラフィッシュを水を含むD-グルコース（111mM）に14日間浸漬することによって誘導される。これらの異なるアプローチについて、血糖値の測定値が記載されている。高血糖が構成的に及ぼす影響を調べる方法終脳の機械的傷害を記述し、脳を解剖し、パラフィン包埋し、ミクロトームで切片化し、免疫組織化学的手順を実施することによって再生神経発生を実証する。最後に、PET / CTを用いた放射標識分子（ここでは[ 18 F] -FDG）の生体内分布を研究するための関連モデルとしてゼブラフィッシュを使用する方法も記載されている。
概要
高血糖は、過剰な血糖値として定義される。急性ストレスの状況を反映することができるが、高血糖はまたしばしば糖尿病の診断、インスリン分泌および/または耐性の慢性障害につながる状態である。 2016年に糖尿病で暮らす成人の数は世界で4億2200万人に達し、毎年150万人がこの病気で死亡し、大きな健康問題となっています1 。実際、制御されていない糖尿病は、心臓血管系、腎臓、および末梢および中枢神経系に影響を及ぼすいくつかの生理学的障害を引き起こす。
興味深いことに、急性および慢性の高血糖は認知を変え、認知症およびうつ病の両方に寄与する可能性があります2,3,4,5,6。さらに、患者の入院高血圧症は、虚血性脳卒中後の機能的、神経学的、および生存の転帰に関連している7,8,9,10,11。高血糖症/糖尿病は、神経幹細胞の活動やニューロンの分化、移動、生存に影響を及ぼすことにより、成人の神経新生、新しいニューロンの生成につながる過程に影響を与えることも示された2,12。
哺乳動物とは対照的に、ゼブラフィッシュのようなテンポラリーフィッシュは、脳全体に強い神経性活動を示し、成人期の脳修復能力が13,14,15,16で顕著である。特に、このような能力は、neuの持続性のために可能であるラジアルグリアおよび神経芽細胞を含む幹/前駆細胞17,18,19。さらに、ゼブラフィッシュは、最近、肥満およ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
成体野生型ゼブラフィッシュ（ Danio rerio ）を標準光周期（14/10時間明/暗）および温度（28℃）条件下で維持した。すべての実験は、フランスとヨーロッパの研究における動物の使用に関するガイドライン（86/609 / EECおよび2010/63 / EU）に従って行われ、地域倫理委員会によって動物実験の承認を受けた。
1.ゼブラフィッシュにおける急性高血糖モデルの確立
- 400mLのトリカインパウダーを97.9mLの水および2.1mLの1M Tris / HCl緩衝液（pH9）に溶解することによって、トリカインのストック溶液（MS-222）を調製する。 pHを7に調整し、-20℃で保存するために等分する。
- 成人ゼブラフィッシュの麻酔薬は、トリカイン（原液）5 mLを魚水100 mL（最終トリカイン濃度0.02％）に入れることで調製する。
- ゼブラフィッシュ（3〜6ヶ月）をタンクから麻酔薬に移して、動きが止まるようにします。
- 再切断されたピペットを使用して魚を移動させ、速やかに吸収性ティッシュペーパー上で乾燥させる。
- 魚を体重測定する。
- 1X PBSに溶解したD-グルコースの注射器を準備し、50μLのD-グルコース（2.5g / kg体重）を注射する。
注：例えば、0.6 gの魚には50μLの3％D-グルコース/ PBS溶液が与....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
この記事で説明した手順を使用して、成人ゼブラフィッシュでD-グルコース（2.5g / kg体重）の腹腔内注射を行い、注射1.5時間後に血糖値の有意な上昇をもたらした（ 図1A ）。 24時間後の注射では、血糖値はD-グルコースとPBS注射魚の間で類似していた12 。慢性的な治療のために、ゼブラフィッシュをD-グルコース水（111mM）に浸し、14日間の治療終了時に高血糖になった（ 図1B ）。
脳細胞増殖に対する高血糖の影響を調べるために、急性および慢性の高血糖の誘導後にゼブラフィッシュの脳についてPCNA免疫組織化学を行った。急性hypergl yorsmiaは脳細胞増殖に影響を与えなかった12 、Dorsemansら（201.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
この研究は、ゼブラフィッシュにおける急性および慢性の高血糖モデルを確立するための様々な方法を記載している。これらの手順の主な利点は、（1）研究に使用する哺乳類の数を減らすこと、（2）設置が簡単で迅速に実施できること、（3）経済的であることである。したがって、このようなモデルは、アテローム血栓症、心臓血管機能不全、網膜症、血液脳関門漏出、および構成的および再生的神経発生を含む様々な生理学的プロセスへのその影響を研究するために、多数の動物に対する高血糖の影響を調べることを可能にする。この研究は、正常または傷害誘発条件下での脳細胞増殖に対する高血糖の影響についての調査を進める方法を説明する。
慢性的な高血糖症処置の1つの重大な制限は、いくつかの実験において、慢性浸潤後にいくつかの魚が高血糖を示さないことであるDグルコース水中（111mMで14日間）。応答性および非応答性魚の割合は、Dorsemansおよび同僚（2016年）がそれぞれ83％対17％と以前に推定している。魚は、年齢、性別、および膵臓β細胞をより多く作ることによって高血糖を補う能力によって、個々の感受性を示す可能性がある
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
潜在的な利益相反は開示されていない。
謝辞
私たちは、ビデオを編集するためのLa RUunion大学のDirection des Usages duNumérique（DUN）、ボイスオーバーのためのLynda-Rose Mottagan、校正のためのMary Osborne-Pellegrinに感謝します（特に、Jean-FrançoisFévrier、Eric Esnault、Sylvain Ducasse）ボイスオーバー、およびCYROIプラットフォームをサポートしています。この作品は、La RUunion大学（BonusQualitéRecherche、Dispositifs incitatifs）、ConseilRégionalde LaRéunion、欧州連合（CPER / FEDER）、およびPhilancia Associationからの助成金によって支えられました。 ACDは、ラ・レユニオン大学（コントラクト・ドクター）の国際学術院からのフェローシップ・グラントの受領者です。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| デジタルカメラ | ライフサイエンス, 日本 | 浜松 ORCA-ER | |
| 使い捨てベースモールド | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| 蛍光顕微鏡 | ニコン, 日本 | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| 血糖値計試験紙 | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| ミクロトーム | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | ||
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| 塩化ナトリウム | Sigma-Aldrich、ドイツ | S9888 | |
| クエン酸ナトリウム三ナトリウム塩脱水 | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| 手術用顕微鏡 | ライカ(フランス | M320-F12 | |
| 組織包埋カセット | 輸入(カナダ) | M490-10 | |
| 組織包埋培地 | ライカバイオシステムズ(米国 | 39602004 | |
| トルエン | シグマ・アルドリッチ(ドイツ) | 244511 | |
| トリカイン MS-222 | シグマ・アルドリッチ(ドイツ | ) A5040 | |
| トリトン X100 | Sigma-Aldrich(ドイツ | X100-500 mL | |
| Vectashield メディウム | Vector Laboratories、米国 | H-1000 | |
| キシレン | シグマ-アルドリッチ、ドイツ | 534056 | |
| 魚株 | AB | ||
| strong>塩水リン酸緩衝液(10X PBS)pH 7.4(1リットル用)< /strong> | 10X PBSを準備するには、次の塩を追加し、蒸留水 | ||
| で1リットルに完了します塩化カリウム(MM:74.55g / mol):2.00 g < / em> | Sigma-Aldrich、ドイツ | 746436 | |
| リン酸カリウム一塩基性(MM:136,09g / mol):2.40g < / em> | Sigma-Aldrich、ドイツ | 795488 | |
| 塩化ナトリウム(MM : 58.44 g/mol): 80.00 g < | em>Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| リン酸二塩基性ナトリウム (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
参考文献
- W. Diabetes. , Available from: http://www.who.int/diabetes/en (2016).
- Ho, N., Sommers, M. S., Lucki, I. Effects of diabetes on hippocampal neurogenesis: links to cognition and depression. Neurosci Biobehav Rev. 37 (8), 1346-1362 (2013).
- Cukierman, T., Gerstein, H. C., Williamson, J. D.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
