תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
תאים בודדים בתוך אוכלוסייה יכול להראות תגובות ומעולם שונות לגירוי 1 פיסיולוגי אחיד, 2, 3, 4. הווריאציה הגנטית של תאים באוכלוסייה היא מנגנון אחד עבור מגוון זה של תגובות, אבל יש גם כמה גורמים שאינם גנטיים שיכול להגדיל את ההשתנות של תגובות, גם באוכלוסייה משובטת של תאים. לדוגמא, הרמות של חלבונים בודדים מולקולות איתות חשובות אחרות יכולות להשתנות על בסיס תא אחר תא, והולידו וריאצית פרופילי ביטוי גנים במורד זרם. בנוסף, הפעלת גנים יכולה להתרחש התפרצויות קצר משך התמלילים 5, 6 שעשויות להיות מוגבל למספר קטן יחסית של תמלילים לכל פרץ 7, 8, 9. כגוןstochasticity ב הפעלת הגן יכול לתרום השתנות מאוד תגובות ביולוגיות והוא יכול לספק יתרון סלקטיבי מיקרואורגניזמים 10 ו בתאי יונקים 1, 2 מגיבים על גירוי פיזיולוגי. בשל שני המקורות הגנטיים שאינם גנטיים של וריאציה, פרופיל ביטוי גנים של כל תא נתון בתגובה לגירוי עשוי להיות שונה באופן משמעותי מפרופיל ביטוי גנים הממוצע המתקבל מדידת התגובה בתפזורת. קביעת המידה שבה תאים בודדים מראים השתנות בתגובה לגירוי דורשת טכניקות עבור הבידוד של תאים בודדים, מדידת רמות ביטוי תמלילי העניין, ועל הניתוח חישובית של נתוני הביטוי שהתקבלו.
ישנן מספר גישות מנסים לאמוד ביטוי גנים בתאים יחידים, מכסי מגוון רחב של עלויות, מספר תמלילי נחקר, ודיוק של כימות. לדוגמא, תא בודד RNA-seq מציע עומק רחב של כיסויי תמליל ואת היכולת לכמת אלף תמלילים ברורים עבור הגנים הביעו הגבוהה ביותר בתאים בודדים; עם זאת, העלות הכרוכה עומק רצף כזה עלולה להיות מרתיעה, אם כי עלויות ממשיכות לרדת. לעומת זאת, קרינת RNA מולקולה בודדת הכלאה באתרו (FISH smRNA) מציעה כימותים מדויקים של תמלילים אפילו נמוך לבטא גנים במחיר סביר לכל גן של עניין; עם זאת, רק מספר קטן של גני מטרה ניתן assayed בתא נתון על ידי גישה זו. מבחני PCR מבוססים כמוני, כמתואר בפרוטוקול זה, לספק את שביל זהב בין הטכניקות הללו. מבחנים אלו להעסיק המכונים PCR microfluidic בזמן אמת לכמת עד 96 תמלילי עניין בכל פעם עד 96 תאים. בעוד כל אחת מהשיטות הנ"ל יש עלויות חומרה נדרשות, את העלות של כל assay qPCR פרט היא יחסיתנָמוּך. פרוטוקול זה מותאם מאחד שהוצע על ידי היצרן של מכונת PCR microfluidic בזמן אמת (פרוטוקול ADP 41, Fluidigm). כדי להפעיל את הערכת מספרם המוחלט של כל תמליל בגישה מבוססת PCR, הרחבנו את הפרוטוקול לעשות שימוש לגבי הבקרה פנימית על amplicons גן המטרה המוכן שניתן להשתמש בה בכל ניסויים מרובים.
כדוגמה של טכניקה זו, כימות של ביטוי גנים מוסדר על ידי p53 מדכא גידולים בתאי סרטן שד אנושיים MCF-7 מתוארת 11. התאים מאותגרים עם סוכן כימי שגורם הפסקות פעמים גדיל DNA. מחקרים קודמים הראו כי התגובה p53 הפסקות DNA פעמיים גדיל מפגין מידה רבה של ההטרוגניות בתאים בודדים, הן מבחינת רמות ה- p53 12 ו בהפעלת גני מטרה מובחנת 11. יתר על כן, p53 מסדיר את הביטוי של למעלה מ -100היטב מאופיין גני מטרה המעורבים מסלולים רבים במורד הזרם, כולל עיכוב מחזור התא, אפופטוזיס, והזדקנות 13, 14. מאז התגובה בתיווך p53 בכל תא היא גם מורכבת ומשתנה, הניתוח של יתרונות המערכת מגישה שבה כמעט 100 גני המטרה ניתן נחקר בו זמנית בתאים בודדים, כמו זו מתוארת להלן. עם שינויים קלים (כגון שיטות חלופיות עבור בידוד תא בודד תמוגה), הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות ללמוד מגוון רחב של סוגי תאים של יונקים, תעתיקים, ואת תגובות הסלולר.
עם הכנה מראש נכונה, סבב מיון תא ומדידת ביטוי גנים יכול להתנהל על פי פרוטוקול זה על פני תקופה של שלושה ימים. העיתוי הבא הוא הציע: מראש, בחר את תמלילי העניין, לזהות ולאמת את הזוגות פריימר כי להגביר את cDNA מאלה transcripts, ולהכין את הסטנדרטים ותערובות פריימר באמצעות פריימרים אלו. ביום 1, לאחר טיפול בתא, קציר ולמיין את התאים, לבצע שעתוק לאחור והגברת יעד ספציפי, ולטפל דגימות עם exonuclease להסיר פריימרים מאוגדים. ביום 2, לבצע בקרת איכות על תאים ממוינים באמצעות qPCR. לבסוף, ביום 3, למדוד את ביטוי הגנים בתאים המסודרים באמצעות microfluidic qPCR. איור 1 מסכם את השלבים הכרוכים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצגנו שיטה לבידוד בתאי יונקים בודדים מתוך אוכלוסייה של תאי חסיד הגדלים בתרבית ועבור מנסה לאמוד את הביטוי של כ 96 גנים בכל תא. הכנה מראש טוב הוא קריטי עבור בשיטה זו כדי לעבוד היטב. בפרט, בעיצוב פריימר בדיקות זוגות מסוימים אל תעתיקי עניין (שלבי 1.2-1.3) צורכים זמן אבל חשובי צ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות V. קאפור ב Core cytometry זרימת CCR ETIB עבור לעזרתה בביצוע מיון התא במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. אנו מודים גם מ Raffeld ויחידת האבחון המולקולרי CCR LP וג 'ג' ו ואת רצף NHLBI דנ"א ג'נומיקס Core עבור לעזרתם בביצוע qPCR במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. מחקר זה נתמך על ידי התכנית העירונית של NIH.
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
References
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+ (2006).
- Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
- Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+ (2015).
- Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
- Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
- Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
- Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
- Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134 (2012).
- . . PCR Technologies: A Technical Guide. , (2014).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
- . . Flow Cytometry: Principles and Applications. , (2007).
- . . Real-time PCR. , (2006).
- Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328 (2012).
- Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
- Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
- Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
- Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
