एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा आंतरिक मानकों के साथ FACS और qPCR का उपयोग
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
आबादी में व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए एक समान शारीरिक प्रोत्साहन 1, 2, 3, 4 के लिए व्यापक रूप से भिन्न प्रतिक्रियाएं दिखा सकते हैं। आबादी में कोशिकाओं के आनुवंशिक परिवर्तन प्रतिक्रियाओं की इस किस्म के लिए एक तंत्र है, लेकिन वहाँ भी कर रहे हैं कई गैर आनुवांशिक कारक है कि प्रतिक्रियाओं की परिवर्तनशीलता बढ़ा सकते हैं, यहां तक कि कोशिकाओं का एक प्रतिरूप जनसंख्या में। उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत प्रोटीन और अन्य महत्वपूर्ण संकेतन अणुओं के स्तर को नीचे की ओर जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में बदलाव को जन्म दे रही है, एक सेल द्वारा सेल के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, जीन सक्रियण टेप 5, 6 कि फट 7, 8, 9 प्रति टेप की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या को सीमित किया जा सकता है की छोटी अवधि के फटने में हो सकता है। ऐसाजीन सक्रियण में stochasticity बहुत जैविक प्रतिक्रियाओं में परिवर्तनशीलता के लिए योगदान कर सकते हैं और एक चयनात्मक लाभ सूक्ष्मजीवों 10 में और स्तनधारी कोशिकाओं 1, 2 एक शारीरिक उत्तेजना का जवाब दे सकता है। भिन्नता के दोनों आनुवंशिक और गैर-आनुवंशिक स्रोतों के कारण, एक उत्तेजना के जवाब में किसी भी कोशिका के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल औसत जीन अभिव्यक्ति थोक प्रतिक्रिया की माप से प्राप्त प्रोफ़ाइल से काफी भिन्न हो सकते हैं। किस हद तक अलग-अलग कोशिकाओं को एक उत्तेजना के जवाब में परिवर्तनशीलता दिखाने का निर्धारण व्यक्ति की कोशिकाओं के अलगाव के लिए तकनीक की आवश्यकता है, ब्याज के टेप के लिए अभिव्यक्ति के स्तर की माप, और जिसके परिणामस्वरूप अभिव्यक्ति डेटा के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण।
एकल कक्षों में जीन की अभिव्यक्ति परख करने की क्रिया, लागत की एक विस्तृत रेंज को कवर करने के लिए कई दृष्टिकोण हैं, टेप की संख्या की जांच की, औरमात्रा का ठहराव की सटीकता की। उदाहरण के लिए, एकल कोशिका शाही सेना Seq प्रतिलेख कवरेज और व्यक्ति की कोशिकाओं में सबसे उच्च व्यक्त जीनों के लिए अलग टेप के हजारों यों की क्षमता की एक विस्तृत गहराई प्रदान करता है; हालांकि, इस तरह अनुक्रमण गहराई के साथ जुड़े लागत निषेधात्मक जा सकता है, हालांकि लागत कम करने के लिए जारी है। इसके विपरीत, सीटू संकरण (smRNA मछली) में एकल अणु आरएनए प्रतिदीप्ति के लिए टेप की सटीक मात्रा का ठहराव प्रदान करता है यहां तक कि कम व्यक्त ब्याज की जीन प्रति एक उचित कीमत पर जीन; हालांकि, केवल लक्ष्य जीन की एक छोटी संख्या इस दृष्टिकोण से एक दिया सेल में यत्न किया जा सकता है। मात्रात्मक पीसीआर आधारित assays, इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, इन तकनीकों के बीच एक बीच का रास्ता प्रदान करते हैं। ये assays एक microfluidic वास्तविक समय पीसीआर मशीन को रोजगार अप करने के लिए 96 कोशिकाओं में एक समय में ब्याज के 96 टेप करने के लिए यों तो। जबकि ऊपर उल्लिखित तरीकों में से प्रत्येक अपेक्षित हार्डवेयर की कीमत है, किसी भी व्यक्ति qPCR परख की लागत अपेक्षाकृत हैकम। इस प्रोटोकॉल एक एक microfluidic वास्तविक समय पीसीआर मशीन के एक निर्माता (प्रोटोकॉल ADP 41, Fluidigm) द्वारा सुझाए से अनुकूलित है। एक पीसीआर आधारित दृष्टिकोण में प्रत्येक प्रतिलिपि की पूर्ण संख्या के आकलन को सक्षम करने के लिए, हम प्रोटोकॉल है कि कई प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है तैयार लक्ष्य जीन amplicons की आंतरिक नियंत्रण का उपयोग करने के लिए विस्तार किया है।
इस तकनीक का एक उदाहरण के रूप में, MCF 7 मानव स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं में ट्यूमर शमन P53 द्वारा विनियमित जीनों की अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव 11 में वर्णित है। कोशिकाओं को एक रासायनिक एजेंट है कि डीएनए डबल कतरा टूटता लाती साथ चुनौती दी है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि डीएनए डबल कतरा टूटता P53 प्रतिक्रिया व्यक्ति की कोशिकाओं में विविधता का एक बड़ा सौदा दर्शाती है, दोनों स्तरों P53 12 के संदर्भ में और विशिष्ट लक्ष्य जीन की सक्रियता के 11 में है। इसके अलावा, P53 100 से अधिक की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता हैअच्छी तरह से विशेषता सेल चक्र गिरफ्तारी, apoptosis, और वार्धक्य 13, 14 सहित कई बहाव के रास्ते में शामिल लक्ष्य जीन। चूंकि प्रत्येक कोशिका में P53 की मध्यस्थता प्रतिक्रिया दोनों जटिल और चर रहा है, एक दृष्टिकोण से सिस्टम को लाभ का विश्लेषण है जिसमें लगभग 100 लक्ष्य जीन एक साथ इस तरह के नीचे वर्णित है कि जैसे व्यक्ति की कोशिकाओं में जांच की जा सकती। मामूली संशोधनों (जैसे एकल कोशिका अलगाव और सेल के लिए वैकल्पिक तरीकों के रूप में) के साथ, प्रोटोकॉल आसानी से स्तनधारी सेल प्रकार, टेप, और सेलुलर प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
उचित अग्रिम तैयारी के साथ, सेल छँटाई और जीन अभिव्यक्ति माप का एक चक्कर तीन दिन की अवधि में इस प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया जा सकता है। निम्नलिखित समय का सुझाव दिया है: अग्रिम में, ब्याज के टेप चयन की पहचान करने और प्राइमर जोड़े कि उन transcr से सीडीएनए बढ़ाना मान्यIPTS, और मानकों और प्राइमर घोला जा सकता है उन प्राइमरों का उपयोग तैयार करते हैं। दिन 1 पर, सेल उपचार, फसल के बाद और कोशिकाओं, रिवर्स प्रतिलेखन और विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन करते हैं, और अनिगमित प्राइमरों दूर करने के लिए एक exonuclease के साथ नमूनों का इलाज। दिन 2 पर, qPCR का उपयोग कर हल कोशिकाओं पर गुणवत्ता नियंत्रण करते हैं। अंत में, दिन 3 पर, microfluidic qPCR का उपयोग कर हल कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति को मापने। चित्रा 1 शामिल कदम का सार।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम संस्कृति में विकसित पक्षपाती कोशिकाओं की आबादी से अलग-अलग स्तनधारी कोशिकाओं को अलग करने के लिए और प्रत्येक कोशिका में लगभग 96 जीनों की अभिव्यक्ति परख करने की क्रिया के लिए एक विधि प्रस्तुत किया है। ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान सेल छँटाई प्रदर्शन करने में उसकी सहायता के लिए सीसीआर ETIB से फ्लो कोर में वी कपूर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। हम भी इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान qPCR प्रदर्शन करने में उनकी सहायता के लिए एम Raffeld और सीसीआर एल.पी. आण्विक निदान यूनिट और जे झू और NHLBI डीएनए अनुक्रमण और जीनोमिक्स कोर धन्यवाद। इस शोध एनआईएच के अंदर का प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
References
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