Encelliga profilering av genuttryck med FACS och qPCR med interna standarder
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
Individuella celler i en population kan visa vitt skilda svar på en enhetlig fysiologisk stimulans 1, 2, 3, 4. Den genetiska variationen av celler i en population är en mekanism för denna rad olika svar, men det finns också flera icke-genetiska faktorer som kan öka variationen av svar, även i en klonal population av celler. Till exempel kan halterna av individuella proteiner och andra viktiga signalmolekyler variera för en cell-för-cell-basis, vilket ger upphov till variation i nedströms genuttrycksprofilerna. Dessutom kan genaktivering uppstå i kortvariga skurar av transkript 5, 6 som kan begränsas till ett relativt litet antal utskrifter per skur 7, 8, 9. Sådanstochasticity i genaktivering kan i hög grad bidra till variabilitet i biologiska svar och kan ge en selektiv fördel i mikroorganismer 10 och i däggdjursceller 1, 2 svarar på en fysiologisk stimulans. På grund av både genetiska och icke-genetiska källor till variation, kan genen uttrycksprofilen för en given cell som svar på ett stimulus skiljer sig mycket från den genomsnittliga genuttryck profil som erhålls från mätningen av bulk respons. Om den utsträckning i vilken individuella celler visar variabilitet som svar på ett stimulus kräver tekniker för isolering av enskilda celler, mätning av uttrycksnivåer för transkript av intresse, och den beräkningsmässiga analys av de resulterande expressionsdata.
Det finns flera metoder för att analysera genuttryck i enskilda celler, som täcker ett brett spektrum av kostnader, antal transkript sonde, ochnoggrannhet kvantifiering. Till exempel, erbjuder enkel-cell-RNA-Seq ett brett djup av transkriptet täckning och förmågan att kvantifiera tusentals distinkta transkript för de högst uttryckta gener i individuella celler; dock kan kostnaden i samband med en sådan sekvense djup vara oöverkomliga, även om kostnaderna fortsätter att minska. Omvänt enda molekyl RNA fluorescens in situ hybridisering (smRNA FISH) ger exakt kvantifiering av transkript för ännu låg-uttryckande gener till en rimlig kostnad per gen av intresse; kan emellertid endast ett litet antal av målgener analyseras i en given cell genom detta tillvägagångssätt. Kvantitativa PCR-baserade analyser, som beskrivs i detta protokoll, ge en medelväg mellan dessa tekniker. Dessa analyser utnyttjar en mikroflödesrealtids-PCR maskin för att kvantifiera upp till 96-transkript av intresse i taget i upp till 96 celler. Medan var och en av de ovan nämnda metoder har erforderliga kostnader hårdvara, är kostnaden för varje enskild qPCR analys relativtlåg. Detta protokoll är anpassad från en föreslagits av en tillverkare av en mikroflödesrealtids-PCR maskin (Protokoll ADP 41, Fluidigm). För att möjliggöra en uppskattning av det absoluta antalet av varje transkript i en PCR-baserad metod, har vi utökat protokoll för att använda sig av den interna kontrollen av beredda målgenprodukter amplikoner som kan användas i flera experiment.
Som ett exempel på denna teknik, är kvantifiering av uttrycket av gener som regleras av den tumörundertryckande p53 i MCF-7 humana bröstkarcinomceller beskrivna 11. Cellerna utmanas med ett kemiskt medel som inducerar DNA-dubbelsträngbrott. Tidigare studier har visat att p53-gensvaret till DNA-dubbelsträngbrott uppvisar en hel del heterogenitet i enskilda celler, både i termer av p53 nivåer 12 och i aktiveringen av distinkta målgener 11. Dessutom reglerar p53 uttryck för över 100välkarakteriserade målgener involverade i ett flertal nedströms vägar, inklusive cellcykelstopp, apoptos, och åldrande 13, 14. Eftersom p53-medierat svar i varje cell är både komplex och variabel, analysen av förmånerna från ett synsätt där nästan 100 målgener kan sonderas samtidigt i enskilda celler, såsom den som beskrivs nedan. Med smärre ändringar (såsom alternativa metoder för encelliga isolering och lys) kan protokollet lätt anpassas för att studera ett brett spektrum av däggdjurscelltyper, utskrifter och cellulära svar.
Med rätt förberedelser kan en runda cellsortering och genuttryck mätning utföras enligt detta protokoll under en period av tre dagar. Följande timing föreslås: i förväg, välja utskrifter av intresse, identifiera och validera primerpar som förstärker cDNA från de transcrIPTS, och förbereda de standarder och primer blandningar med hjälp av dessa primers. På dag 1 efter cellbehandling, skörd och sortera cellerna, utföra omvänd transkription och specifik målamplifiering, och behandla proverna med ett exonukleas för att avlägsna ej inkorporerade primrar. På dag 2, utföra kvalitetskontroll på sorterade celler med hjälp av qPCR. Slutligen, på dag tre, mäta genuttryck i de sorterade cellerna med hjälp av mikroflödes qPCR. Figur 1 sammanfattar stegen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har presenterat en metod för att isolera enskilda däggdjursceller från en population av vidhäftande celler odlas i kultur och för att analysera uttrycket av cirka 96 gener i varje cell. Bra förberedelser är avgörande för denna metod för att fungera bra. I synnerhet utforma och testa primerpar är specifika för utskrifter av intresse (steg från 1,2 till 1,3) är tidskrävande men viktiga steg, som primers bestämma kvaliteten på mätningarna encelliga. När tillförlitliga primerpar har erhållits, använ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka V. Kapoor i CCR ETIB Flow Cytometry Kärna för hennes stöd för att utföra cellsortering under utvecklingen av detta protokoll. Vi vill också tacka M. Raffeld och enheten CCR LP molekylär diagnostik och J. Zhu och NHLBI DNA-sekvensering och Genomics Kärna för deras stöd att utföra qPCR under utvecklingen av detta protokoll. Denna forskning stöddes av Intramural Program för NIH.
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
References
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+ (2006).
- Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
- Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+ (2015).
- Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
- Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
- Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
- Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
- Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134 (2012).
- . . PCR Technologies: A Technical Guide. , (2014).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
- . . Flow Cytometry: Principles and Applications. , (2007).
- . . Real-time PCR. , (2006).
- Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328 (2012).
- Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
- Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
- Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
- Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
