यहाँ, हम मानव गर्भनाल (यूसी) और हड्डी में भ्रूण नाल नमूना अस्तर (सीएल) अलगाव के लिए, व्हार्टन जेली (WJ), रस्सी-नाल जंक्शन (CPJ), और भ्रूण नाल (एफपी) के विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और मेसेंकाईमल stromal कोशिकाओं (MSCs) explant संस्कृति तकनीक का उपयोग कर के लक्षण वर्णन।
मानव गर्भनाल (UC) और प्लेसेंटा मेसेंकाईमल stromal कोशिकाओं (MSCs) कि तेजी से ध्यान प्राप्त की है क्योंकि वे किसी भी नैतिक या नैतिक चिंताओं पैदा नहीं करते की, गैर इनवेसिव आदिम और प्रचुर मात्रा में स्रोत हैं। मौजूदा तरीकों यूसी से MSCs अलग करने के लिए चर प्रसार क्षमता के साथ कोशिकाओं की कम मात्रा उपज। चूंकि यूसी एक संरचनात्मक रूप से-जटिल अंग है, एमएससी के गुणों के अंतर उनके अलगाव की संरचनात्मक क्षेत्रों में अंतर के कारण हो सकता है। यूसी, रस्सी-नाल जंक्शन (CPJ), और भ्रूण नाल (एफपी): इस अध्ययन में, हम पहले तीन असतत संरचनात्मक क्षेत्रों में की हड्डी / नाल नमूने विच्छेदित। दूसरा, दो अलग-अलग क्षेत्रों, कॉर्ड अस्तर (सीएल) और व्हार्टन जेली (WJ), अलग हो गए थे। explant संस्कृति तकनीक फिर चार स्रोतों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया गया। समय explants से कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति के लिए आवश्यक ऊतक के स्रोत के आधार पर अलग-अलग। 4 दा – कोशिकाओं के परिणाम के भीतर 3 हुईCPJ explants के वाईएस, जबकि विकास 7 के बाद मनाया गया – 10 दिन और 11 – सीएल / WJ और एफपी explants से 14 दिनों में क्रमश:। पृथक कोशिकाओं प्लास्टिक के पक्षपाती थे और इसी तरह अस्थि मज्जा (बीएम) व्युत्पन्न MSCs के लिए, इस तरह के CD29, CD44, CD73, CD90, और CD105 के रूप में fibroblastoid आकृति विज्ञान और सतह मार्करों, का प्रदर्शन किया। हालांकि, कोशिकाओं विविध की कॉलोनी बनाने दक्षता, CPJ-MSCs और WJ-MSCs साथ बी.एम.-MSCs की तुलना में अधिक दक्षता को दर्शाता है। सभी चार स्रोतों से MSCs adipogenic, chondrogenic, और osteogenic प्रजातियों में विभक्त होता, यह दर्शाता है कि वे multipotent थे। CPJ-MSCs अन्य एमएससी स्रोतों की तुलना में और अधिक कुशलता से अलग करता है। इन परिणामों का सुझाव है कि CPJ सबसे शक्तिशाली संरचनात्मक क्षेत्र है और कोशिकाओं के एक उच्च संख्या, इन विट्रो में अधिक से अधिक प्रसार और आत्म नवीकरण क्षमता के साथ अर्जित करता है। अंत में, चार स्रोतों से MSCs का तुलनात्मक विश्लेषण संकेत दिया कि CPJ सेल थेरेपी, regenerativ के लिए MSCs का एक और अधिक आशाजनक स्रोत हैई चिकित्सा, और ऊतक इंजीनियरिंग।
स्टेम सेल विभिन्न अंगों और शरीर के ऊतकों में मौजूद हैं। वे पुनर्योजी क्षमता के अधिकारी और मानव जीवन 1, 2 की अवधि के दौरान शरीर में क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं। इस वयस्क स्टेम सेल (ASCs), में ब्याज की एक महान सौदा विशेष रूप से के बाद से उत्पन्न किया है, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) के विपरीत, ASCs के उपयोग के नैतिक और नैतिक दुविधाओं पैदा नहीं करता है। कई अध्ययनों से इस तरह के मेसेंकाईमल stromal कोशिकाओं (MSCs) के रूप में ASCs, के अलगाव की सूचना दी है; hematopoietic स्टेम सेल (HSCs); और विभिन्न वयस्क अस्थि मज्जा (बीएम) वसा ऊतकों (एटी) और दंत लुगदी 3, 4, 5 से लेकर स्रोतों सहित विभिन्न पूर्वज,। हालांकि, वर्तमान ASCs की संख्या में वयस्क आलों के सबसे सीमित है, और उनके अलगाव आम तौर पर संभव दाता के साथ एक आक्रामक और दर्दनाक प्रक्रिया शामिल हैसाइट रुग्णता। इसके अलावा, दाता उम्र और पर्यावरण के तनाव भी गुणवत्ता और पृथक कोशिकाओं 6, 7, 8 की जैविक गतिविधि का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है। ASCs भी इन विट्रो में संस्कृति के दौरान सीमित प्रसार और भेदभाव संभावित प्रदर्शित करते हैं।
वर्तमान ASCs की इन कमियों को दूर करने के लिए नए स्रोतों स्टेम कोशिकाओं को अलग करने का पीछा किया गया है। इन प्रयासों के गर्भनाल रक्त, गर्भनाल ऊतक, नाल, और एमनियोटिक द्रव 9 सहित प्रसवकालीन स्रोतों से स्टेम सेल के अलगाव के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। इन स्रोतों क्योंकि उनके आसान और प्रचुर मात्रा में उपलब्धता 10, 11, 12, 13 का ध्यान प्राप्त की है। उन लोगों से व्युत्पन्न इसके अलावा, प्रसवकालीन ऊतकों गैर invasively प्राप्त किया जा सकता है, और स्टेम कोशिकाओं रहे हैंवयस्क स्रोतों 14, 15 से अलग ASCs की तुलना में अधिक आदिम। वे जन्म के समय प्राप्त ऊतकों से अलग हैं और उम्र बढ़ने और पर्यावरण तनाव की वजह से 16 जीनोम में कम से कम परिवर्तन आया है माना जाता है।
हालांकि, प्रसवकालीन स्रोतों से स्टेम कोशिकाओं की विशेषताओं और करने के लिए अपनी क्षमता स्वयं को नवीनीकृत करने के साथ ही अंतर करने के लिए व्यापक रूप से 11 में भिन्नता है, 17। यह तथ्य यह है कि मानव गर्भनाल (यूसी) एक जटिल अंग है की वजह से भाग में हो सकता है। हम परिकल्पना है कि प्रसवकालीन ऊतक के असतत क्षेत्रों विविधताओं और गैर प्रसवकालीन स्रोतों से प्राप्त ASCs की तुलना में इन स्टेम कोशिकाओं की अधिक आदिम प्रकृति के लिए जिम्मेदार, विशिष्ट चीजों पैदा करते हैं। यूसी, रस्सी-नाल जंक्शन (CPJ), एक: इस अध्ययन तीन असतत संरचनात्मक क्षेत्रों में की हड्डी / नाल नमूनों की विच्छेदन का वर्णन करता हैघ भ्रूण नाल (एफपी)। यूसी और दो क्षेत्रों में विच्छेदित किया गया था: कॉर्ड अस्तर (सीएल) और व्हार्टन जेली (WJ)। सीएल, WJ, CPJ, और एफपी से अलग कोशिकाओं के विश्लेषण का प्रदर्शन किया है कि वे सभी fibroblastoid आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया और एमएससी मार्करों व्यक्त की, लेकिन वे अपने आत्म नवीकरण और भेदभाव क्षमता में मतभेद था। UC- और एफपी व्युत्पन्न कोशिकाओं की तुलना में, उनमें सेल थेरेपी, पुनर्योजी चिकित्सा, और ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक अधिक आशाजनक स्रोत बना CPJ-व्युत्पन्न कोशिकाओं प्रसार और आत्म नवीकरण क्षमता का एक उच्च दर का प्रदर्शन किया।
स्टेम सेल अनुसंधान में हाल के अग्रिमों न केवल बुनियादी विकास प्रक्रियाओं की समझ में सुधार, लेकिन यह भी जैव प्रौद्योगिकी, दवा, सेल थेरेपी, पुनर्योजी चिकित्सा, और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों 18, 19, 20 में स्टेम कोशिकाओं के उपयोग के लिए आशाजनक अवसर प्रदान। शुरुआती भ्रूण से अलग pluripotent ESCs सबसे होनहार हैं, वे तकनीकी चुनौतियों और नैतिक दुविधाओं 21, 22, 23 का सामना। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) वयस्क कोशिकाओं से व्युत्पन्न एक विकल्प प्रदान करते हैं, लेकिन वे भी इसी तरह की तकनीकी और सुरक्षा समस्याओं 23 सामना करते हैं। इसके अलावा, IPSCs आनुवंशिक रूप से स्थिर नहीं हो सकता है या, आया आनुवंशिक परिवर्तन हो सकता है इस प्रकार उनके चिकित्सकीय प्रयोग सीमित। स्टेम सेल भी प्रसव के बाद Tis की एक किस्म में सूचित किया गया हैमुकदमा और अंगों। इन ASCs का सबसे आम स्रोतों अस्थि मज्जा, वसा, और मांसपेशियों के ऊतकों हैं। हालांकि, प्रसव के बाद स्रोतों से ASCs विकास और भेदभाव संभावित 24, 25 तक ही सीमित है। उन्होंने यह भी वजह से उम्र बढ़ने और पर्यावरण तनाव के संपर्क में रहने से पीड़ित है और इस तरह हमेशा चिकित्सीय अनुप्रयोगों 26, 27, 28 के लिए प्रभावी नहीं हैं। यह है कि ASCs की तुलना में अधिक भोली हैं स्टेम सेल के नए स्रोतों के लिए खोज करने के लिए हमें और दूसरों को प्रेरित किया है।
हम ASCs के लिए एक विकल्प के रूप में आदिम स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रसवकालीन स्रोतों की जांच की है। इस रिपोर्ट में, हम की हड्डी / नाल नमूनों से मानव MSCs अलग करने के लिए एक विश्वसनीय, मजबूत, और सरल विधि प्रदान करते हैं। अन्य स्रोतों और तरीकों ASCs के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया की तुलना में, इस विधि hig की एक बड़ी मात्रा अलग करने के लिए एक कुशल और गैर इनवेसिव तरीका प्रदान करता हैज गुणवत्ता MSCs। आगे यह भी इस तरह के बी.एम. के रूप में वयस्क स्रोतों से MSCs की तुलना में प्रसवकालीन MSCs की उच्च विकास दर और भेदभाव संभावित accentuates।
यूसी नाल को भ्रूण संलग्न दो धमनियों, एक नस, सीएल सहित विशिष्ट संरचनात्मक क्षेत्रों, के साथ एक बड़ा अंग है, और WJ (रक्त वाहिकाओं आसपास के ऊतकों)। कई अध्ययनों से पूरी की हड्डी, WJ, या प्लेसेंटा से MSCs के अलगाव, चर वृद्धि के साथ सूचित किया है और भेदभाव 25 क्षमता, 29। फिर भी, आज तक कोई अध्ययन को प्रभावी ढंग से जांच की और रस्सी / नाल नमूना के विभिन्न संरचनात्मक क्षेत्रों से कोशिकाओं की तुलना में किया गया है। हम यहाँ यूसी, CPJ के विच्छेदन के लिए एक व्यवस्थित और सरल विधि प्रदान करते हैं और MSCs के अलगाव के लिए एफपी जुड़ा हुआ है। हम यह भी विशेषताएँ और उनके प्रसार capabil के निर्धारण से अलग कोशिकाओं की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए एक व्यापक और सरल प्रोटोकॉल दिखानेities, साथ ही उनके आत्म नवीकरण और भेदभाव क्षमता। इस विधि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और बेहतरीन गुणवत्ता वाले MSCs की एक बड़ी राशि अर्जित करता है।
हमने पाया है कि आकार में ऊतक टुकड़े 1-2 मिमी आंशिक पाचन explants से एक व्यावसायिक ट्रिप्सिन समाधान reproducibly झुकेंगे कोशिकाओं का उपयोग कर, जबकि एकल कक्षों में ऊतक का पूरा पाचन पृथक कक्षों की गरीब पैदावार था। हालांकि, एक अध्ययन की रिपोर्ट है कि यूसी के बड़े ऊतक explants लगभग आकार में 10 मिमी सेल अलगाव 30 के लिए इष्टतम थे। इसके विपरीत, एक और अध्ययन से पता चला है कि ऊतक explant विधि एंजाइम पाचन विधि 31 की तुलना में एक लंबे समय तक संस्कृति चक्र और कोशिकाओं के निचले उपज में हुई। पिछली रिपोर्टों में, हड्डी के उपचार कोलैजिनेज़ द्वितीय और hyaluronidase, अलग से या ट्रिप्सिन निम्नलिखित के साथ ऊतकों, गर्भनाल कोशिकाओं 32, 33 अलग करने के लिए प्रदर्शन किया गया है <sup> 34। इतना ही नहीं वहां संवर्धन करने से पहले गर्भनाल ऊतक के पाचन के तरीकों में बदलाव का एक बड़ा सौदा है, लेकिन यह भी अलग कोशिकाओं विषम प्रतीत होता है। अब समय अवधि के लिए कठोर एंजाइमों के उपयोग कोशिका झिल्ली में कमी आ सकती, सेल पालन और प्रसार को प्रभावित करने वाले। इस विधि के नतीजे बताते हैं कि आंशिक रूप से पच प्रसवकालीन ऊतक explants व्यापक कोशिका क्षति पहुंचाए बिना कोशिकाओं के परिणाम प्रदान की है, व्यवहार्यता बनाए रखा, और MSCs के सजातीय आबादी की अधिक मात्रा में सामने आए।
जबकि explants से विच्छेदन और कोशिकाओं के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल सीधा है, चरणों में से कुछ साबित चुनौतीपूर्ण हो सकता है। सबसे पहले, यह सुनिश्चित explant पालन संस्कृति कुप्पी की सतह के लिए उनके लगाव की अनुमति देकर। इस माध्यम की एक छोटी राशि का उपयोग कर, केवल संस्कृति के पहले 2 घंटे के लिए ऊतक टुकड़े को कवर, और फिर ध्यान से शेष मध्यम जोड़कर मदद की जा सकती। एसecond, कम से कम 15 T75 फ्लास्क प्रति explants की संख्या को सीमित। टुकड़े या कुप्पी के लिए बहुत अधिक टुकड़ों के बीच बहुत कम जगह सेल परिणाम के लिए निरोधात्मक हैं। तीसरा, ऊतक टुकड़े कि ऊष्मायन के 3 दिन के बाद संस्कृति कुप्पी की सतह से टिक नहीं पाता पालन और संवर्धन के लिए एक नई कुप्पी में स्थानांतरित किया जाना चाहिए। चौथा, ऊतक टुकड़े सेल मलबे, जो लगाव को रोकता से मुक्त होना चाहिए संवर्धित किया जा सकता है। पांचवां, बड़े टुकड़ों के संवर्धन अधिक मध्यम की आवश्यकता है और सेल परिणाम दक्षता में सुधार नहीं करता है। अन्त में, explant संस्कृतियों बारीकी से, पर नजर रखने के लिए विशेष रूप से सेल परिणाम की उपस्थिति के बाद के रूप में कोशिकाओं तेजी से संगामी हो जाते हैं और ऊतक स्रोत पर निर्भर करता है को अलग कर सकते हैं। तकनीक का एक कुछ सीमाएं नमूने चीर-फाड़ सीएल, WJ, CPJ, और एफपी अलग करने के लिए विशेषज्ञता की कमी शामिल हैं; एक छोटा सा नमूना आकार, कम WJ उपज में जिसके परिणामस्वरूप; और देरी प्रसंस्करण-नमूने avo करने के लिए संग्रह के 2-4 घंटे के भीतर कार्रवाई की जाने की आवश्यकता हैआईडी सेल वसूली में कमी।
MSCs के लक्षण वर्णन के लिए स्वर्ण मानक, प्लास्टिक का पालन fibroblastic फेनोटाइप फार्म, और कई प्रजातियों में अंतर करने के लिए की क्षमता है। ये भी रूप में ISCT 35 द्वारा वर्णित MSCs परिभाषित करने के लिए सामान्य रूप से प्रयुक्त मानदंड हैं। इस अध्ययन में, सभी चार स्रोतों से अलग कोशिकाओं प्लास्टिक के पक्षपाती थे और एमएससी मार्कर (CD29, CD44, CD73, CD90, और CD105), लेकिन hematopoietic मार्कर CD45 के लिए नकारात्मक अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक अभिव्यक्ति थी। इसके अलावा, वे मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (HLA) वर्ग मैं व्यक्त लेकिन एचएलए वर्ग द्वितीय के लिए नकारात्मक रहे थे। बी.एम.-MSCs की तुलना में, WJ- और CPJ-व्युत्पन्न कोशिकाओं अधिक थी। इन परिणामों के पिछले रिपोर्ट के साथ संगत कर रहे हैं यूसी व्युत्पन्न MSCs 33, 36, 37, 38। इसके अलावा, हमारे नतीजे बताते हैं कि Cl-, WJ-, CPJ-, एफपी-MSCs pluri व्यक्तइस तरह के OCT4, NANOG, और Sox2 के रूप में शक्ति जीन; हालांकि, उनकी अभिव्यक्ति ESCs से कम के रूप में पहले से 39 की सूचना दी थी। इन परिणामों पिछले एक अध्ययन है कि प्रसवकालीन व्युत्पन्न कोशिकाओं 40 में pluripotency मार्कर की अभिव्यक्ति सूचना के साथ समझौते में भी थे। दिलचस्प बात यह है यह देखा गया है pluripotent मार्कर की अभिव्यक्ति अन्य स्रोतों से अलग कक्षों में से CPJ-MSCs में अधिक था कि। यह भी देखा गया था कि यूसी MSCs बी.एम.-MSCs 41 से अधिक आत्म नवीकरण संभावित प्रदर्शन किया। दिलचस्प बात यह है प्ररूपी विशेषताओं में समानता के बावजूद, चार स्रोतों से अलग कोशिकाओं चर CFE मूल्यों था। हालांकि, एफपी-एमएससी के अलावा, वे सब बी.एम.-MSCs की तुलना में बेहतर CFE मूल्यों था। CPJ-MSCs उच्चतम CFE मूल्य और प्रसार की दर था जब अन्य सभी MSCs की तुलना में। इसके अलावा, WJ- और CPJ-MSCs बी.एम.-MSCs की तुलना में अधिक भेदभाव क्षमता का प्रदर्शन किया। सीएल-MSCs कम से कम भेदभाव से पता चलासभी तीन प्रजातियों (यानी, adipogenic, chondrogenic, और osteogenic), जबकि CPJ-MSCs में संभावित उच्चतम trilineage भेदभाव की संभावना थी और एफपी-MSCs कम से कम adipogenic भेदभाव संभावित प्रदर्शन किया।
अंत में, हमारे नतीजे बताते हैं कि गुणवत्ता और अलग MSCs की मात्रा की हड्डी / नाल नमूने में चार स्रोतों के बीच मतभेद था। CPJ-MSCs अधिक प्रसार क्षमता और अधिक से अधिक आत्म नवीकरण की संभावना थी। उन्होंने यह भी trilineage प्रकार की कोशिकाओं में उनके भिन्नता में शक्तिशाली थे। उनके कम दोगुना समय के कारण, CPJ-MSCs तेजी से हो सकता है विस्तार 1,000 गुना और उच्च throughput दवा या biomaterial स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया। इन कोशिकाओं को सेल थेरेपी और पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एक अधिक आशाजनक स्रोत हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
अध्ययन OU-पश्चिम बंगाल ISCRM, ओकलैंड विश्वविद्यालय और मिशिगन सिर और स्पाइन संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। N बीरावोलू और C मैककी ओकलैंड विश्वविद्यालय से प्रोवोस्ट ग्रेजुएट रिसर्च अवार्ड प्राप्त किया। हम पांडुलिपि की समीक्षा करने के लिए एस बख्शी की सराहना करते हैं।
DMEM with 4500 mg/ml glucose | Invitrogen | 11995065 | |
FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
Insulin | Prospec | CYT-270 | |
Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
DNase | Promega | M6101 | |
iScript kit | Biorad | 1708891 | |
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
Crystal violet | Sigma | C3886 | |
Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |