Aqui, apresentam-se um protocolo para a dissecção de cordão umbilical humano (UC) e a amostra da placenta fetal em cordão de revestimento (CL), geleia de Wharton (WJ), junção de cabo-placenta (CPJ), e na placenta fetal (FP) para o isolamento e caracterização de células estromais mesenquimais (MSCs), utilizando a técnica de cultura de explante.
O cordão umbilical humano (UC) e placenta são de fontes não-invasivos, primitivas e abundantes de células estromais mesenquimatosas (MSC) que têm cada vez mais ganharam a atenção porque eles não representam quaisquer preocupações de ordem ética ou morais. Os métodos actuais para isolar MSC da UC produzir quantidades baixas de células com potencial de proliferação variáveis. Uma vez que a UC é um órgão anatomicamente-complexo, diferenças nas propriedades do MSC pode ser devido às diferenças nas regiões anatómicas do seu isolamento. Neste estudo, foram primeiro dissecados as amostras de medula / placenta em três regiões anatómicas distintas: UC, junção cabo-placenta (CPJ), e placenta fetal (FP). Em segundo lugar, duas zonas distintas, cordão de revestimento (CL) e geleia de Wharton (WJ), foram separadas. A técnica de cultura de explante foi então usado para isolar culas a partir das quatro fontes. O tempo necessário para a cultura primária de células dos explantes variou dependendo da origem do tecido. Crescimento das células ocorreu no prazo de 3-4 days dos explantes CPJ, ao passo que o crescimento foi observado após 7 – 10 dias e 11 – 14 dias a partir de Cl / WJ e FP explantes, respectivamente. As células isoladas eram aderentes ao plástico e exibido e morfologia de superfície marcadores fibroblastóides, tais como CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 e, de forma semelhante à da medula óssea (BM) derivada de MSCs. No entanto, a eficiência de formação de colónias das células variou, com CPJ-MSC e WJ-MSCs que mostra a eficiência mais elevada do que o BM-MSCs. MSCs de todas as quatro fontes diferenciadas em adipogênica, condrogênica e linhagens osteogênicas, indicando que eram multipotentes. CPJ-MSCs diferenciado de forma mais eficiente em comparação com outras fontes MSC. Estes resultados sugerem que o CPJ é o mais potente região anatómica e produz um maior número de células, com uma maior capacidade de proliferação e de auto-renovação in vitro. Em conclusão, a análise comparativa das MSCs a partir das quatro fontes indicaram que CPJ é uma fonte mais promissora de MSC para a terapia celular, regenerative medicina e engenharia de tecidos.
As células estaminais estão presentes em vários órgãos e tecidos do corpo. Eles possuem potencial regenerativo e desempenhar um papel importante na reparação de tecidos danificados no corpo por toda a extensão da vida humana 1, 2. Isso tem gerado um grande interesse em células-tronco adultas (ASC), tanto mais que, ao contrário das células-tronco embrionárias (CES), o uso de ASC não representam dilemas morais e éticos. Diversos estudos relataram o isolamento de ASCs, tais como as células estromais mesenquimais (MSCs); as células-tronco hematopoiéticas (HSCs); e diferentes células progenitoras, incluindo as várias fontes de adultos que variam a partir de medula óssea (BM) de tecido adiposo (TA) e polpa dentária 3, 4, 5. No entanto, o nero de ASC presentes na maioria dos nichos adultos é limitado, e o seu isolamento geralmente envolve um procedimento invasivo e doloroso com possível doadormorbidade site. Além disso, a idade do doador e stress ambiental pode também desempenhar um papel significativo na determinação da qualidade e actividade biológica das células isoladas 6, 7, 8. ASC também exibir proliferação limitada e potencial de diferenciação durante a cultura in vitro.
Para superar estas desvantagens de ASC atual, novas fontes tenham sido interpostos para isolar células-tronco. Estes esforços conduziram ao isolamento de células estaminais a partir de fontes perinatal, incluindo o sangue do cordão, fio tecido, a placenta, e fluido amniótico 9. Estas fontes ganharam atenção por causa de sua fácil e abundante disponibilidade de 10, 11, 12, 13. Além disso, os tecidos perinatais podem ser obtidas de forma não invasiva, e as células-tronco derivadas a partir delas sãomais primitivos do que ASC isoladas a partir de fontes de adulto 14, 15. Eles são isoladas a partir de tecidos obtidos no nascimento e são considerados ter sofrido alterações mínimas no genoma devido ao envelhecimento e ambientais stresses 16.
No entanto, as características relatadas de células estaminais a partir de fontes perinatais e o seu potencial de auto-renovação, bem como para diferenciar variar amplamente 11, 17. Isto pode ser em parte devido ao facto de que o cordão umbilical humano (UC) é um órgão complexo. Nós supomos que as regiões discretas de tecido perinatal criar nichos específicos responsáveis pelas variações e natureza mais primitiva destas células estaminais, em comparação com ASC derivadas de fontes não-perinatais. Este estudo descreve a dissecção de amostras de medula / placenta em três regiões discretas anatómicas: UC, junção cabo-placenta (CPJ),d placenta fetal (FP). O UC foi adicionalmente dissecado em duas zonas: cordão de revestimento (CL) e geleia de Wharton (WJ). Análise das células isoladas a partir de Cl, WJ, CPJ, e FP demonstraram que todos eles exibiram morfologia f ibroblastóide e expressa marcadores MSC, mas eles diferem na sua auto-renovação e diferenciação. células CPJ-derivados exibiram uma maior taxa de proliferação e de auto-renovação potencial em comparação com UC-e células FP-derivados, tornando-os de uma fonte mais promissora para a terapia celular, medicina regenerativa e engenharia de tecidos.
Os recentes avanços na investigação sobre células estaminais não só melhorou a compreensão dos processos básicos de desenvolvimento, mas também proporcionou oportunidades promissoras para o uso de células-tronco em biotecnologia, farmacêutica, terapia celular, medicina regenerativa, e aplicações de engenharia de tecidos 18, 19, 20. Enquanto os CES pluripotentes isoladas de embriões são a mais promissora, eles enfrentam desafios técnicos e dilemas éticos 21, 22, 23. As células induzidas pluripotentes estaminais (iPSCs) derivadas de células adultas fornecer uma alternativa, mas eles também enfrentam problemas técnicos e de segurança similares 23. Além disso, iPSCs podem não ser estáveis geneticamente ou podem ter sido submetidos a mudanças genéticas, limitando assim o seu uso terapêutico. As células-tronco também foram relatados em uma variedade de tis pós-natalsues e órgãos. As fontes mais comuns destas ASC são a medula óssea, tecido adiposo e tecido muscular. No entanto, a partir de fontes ASC pós-natais têm limitado potencial de crescimento e de diferenciação 24, 25. Eles também sofrem devido ao envelhecimento e exposição a pressões ambientais e, portanto, nem sempre são eficazes para aplicações terapêuticas 26, 27, 28. Isso nos e outros, levaram a procurar novas fontes de células-tronco que são mais ingênua do que ASC.
Nós temos investigado fontes perinatais para células estaminais primitivas como uma alternativa a ASC. Neste relatório, é proporcionado um método fiável, robusto e simples para isolar as MSCs humanas a partir de amostras de medula / placenta. Em comparação com outras fontes e os métodos utilizados para o isolamento de ASCs, este método proporciona um método eficaz e não invasivo para o isolamento de grandes quantidades de higMSCs h-qualidade. Acentua ainda mais o maior potencial de crescimento e diferenciação das MSCs perinatais em comparação com as MSCs a partir de fontes de adulto, tais como BM.
A UC anexando o feto para a placenta é um grande órgão com regiões anatómicas distintas, incluindo duas artérias, uma veia, Cl, e WJ (tecido que envolve os vasos sanguíneos). Diversos estudos relataram o isolamento de MSCs a partir de todo o cabo, o WJ, ou a placenta, com um crescimento variável e diferenciação potenciais de 25, 29. No entanto, até à data, nenhum estudo efectivamente investigado e comparado as células de diferentes regiões anatómicas da amostra de medula / placenta. Nós fornecemos aqui um método sistemático e simples para a dissecção da UC, o CPJ, e conectado FP para o isolamento de MSCs. Mostramos também um protocolo abrangente e simples para caracterizar e avaliar a qualidade das células isoladas por determinação da sua capabil proliferaçãodades, bem como as suas potencialidades auto-renovação e diferenciação. Este método é reprodutível e origina uma grande quantidade de MSCs de qualidade superior.
Descobrimos que a digestão parcial de pedaços de tecido de 1-2 mm de tamanho utilizando uma solução de tripsina comercial que produziu as células reprodutível a partir dos explantes, enquanto que a digestão completa de tecido em células individuais tiveram rendimentos pobres de células isoladas. No entanto, um estudo relatou que maiores explantes de tecido de UC aproximadamente 10 mm de tamanho foram óptimos para o isolamento de células 30. Por outro lado, outro estudo sugere que o método de explante de tecido resultou em um ciclo de cultura mais longo e menor rendimento de células em comparação com o método de digestão com enzimas de 31. Em relatórios anteriores, o tratamento de tecidos com fio colagenase II e hialuronidase, separadamente ou na sequência da tripsina, foram realizadas para isolar células do cordão 32, 33 <sup>, 34. Não só há uma grande variação nos métodos de digestão do tecido do cordão antes da cultura, mas também as células isoladas parecia ser heterogêneo. O uso de enzimas duras por períodos de tempo mais longos pode degradar a membrana celular, que afecta a adesão e proliferação celular. Os resultados deste método revelou que parcialmente digeridos explantes de tecido perinatais fornecida crescimento de células sem causar dano celular extensa, manteve a viabilidade, e obteve-se maiores quantidades de populações homogéneas de MSCs.
Embora o protocolo para a dissecção e isolamento de células a partir dos explantes é simples, alguns dos passos podem provar ser um desafio. Em primeiro lugar, garantir a adesão explante, permitindo a sua fixação à superfície do frasco de cultura. Isto pode ser facilitada pela utilização de uma pequena quantidade de meio, cobrindo apenas os pedaços de tecido para as primeiras 2 h de cultura, e, em seguida, adicionando cuidadosamente o meio restante. Segunda, limitar o número de explantes para menos do que 15 por frasco T75. Muito pouco espaço entre as peças ou muitas peças por frasco são inibitórios para crescimento celular. Terceiro, os pedaços de tecido que não aderem à superfície do frasco de cultura após 3 dias de incubação deve ser transferida para um novo frasco de cultura e aderência. Em quarto lugar, pedaços de tecido a ser cultivado deve ser livre de detritos celulares, que inibe a ligação. Em quinto lugar, a cultura de grandes pedaços requer mais médio e não melhora a eficiência conseqüência celular. Por fim, as culturas de explantes monitorizar de perto, em particular após o aparecimento de crescimento de células, como as células podem tornar-se rapidamente confluente e diferenciar dependendo da fonte de tecido. Algumas limitações da técnica incluem a falta de especialização em dissecando as amostras para separar o CL, WJ, CPJ, e FP; um pequeno tamanho da amostra, o que resulta em baixo rendimento WJ; e retardados de processamento-as amostras são obrigados a ser processado dentro de 2-4 h de recolha de avoID de uma perda na recuperação de células.
O padrão de ouro para a caracterização das MSCs é a capacidade de aderir ao plástico, formar o fenótipo fibroblástica, e diferenciar-se em múltiplas linhagens. Estes são também os critérios normalmente utilizados para a definição de MSC, conforme descrito pelo ISCT 35. Neste estudo, as células isoladas a partir de todos os quatro fontes eram aderentes ao plástico e tiveram express positiva para os marcadores de MSC (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 e), mas a expressão negativa para o marcador CD45 hematopoiético. Além disso, eles expressa antigénio de leucócitos humanos (HLA) de classe I, mas foram negativos para HLA de classe II. Em comparação com o BM-MSCs, WJ- e células CPJ-derivados eram mais elevados. Estes resultados são consistentes com os relatórios anteriores de UC-derivado MSC 33, 36, 37, 38. Além disso, os nossos resultados mostraram que CL, WJ-, CPJ-, FP-MSC expressa plurigenes de potência, tais como OCT4, NANOG, e SOX2; no entanto, a sua expressão foi mais baixa do que a de CES, como relatado anteriormente 39. Estes resultados eram também de acordo com um estudo anterior que relataram a expressão de marcadores de pluripotência em células perinatais-40 derivada. Curiosamente, verificou-se que a expressão do marcador pluripotentes foi maior em CPJ-MSC do que em células isoladas a partir de outras fontes. Observou-se também que a UC-MSCs exibiu maior potencial de auto-renovação do BM-MSCs 41. Curiosamente, apesar de semelhança das suas características fenotípicas, as células isoladas a partir dos quatro fontes tinham valores CFE variáveis. No entanto, com exceção de FP-MSC, todos eles tinham melhores valores CFE que BM-MSCs. CPJ-MSCs teve o maior valor CFE e taxa de proliferação quando comparado com todos os outros MSCs. Além disso, WJ- e CPJ-MSC exibidos os potenciais de diferenciação mais elevadas do que BM-MSCs. CL-MSC mostrou a diferenciação menospotencial em todas as três linhagens (ou seja, adipogica, condrogénica, e osteogénicas), enquanto CPJ-MSC teve o maior potencial de diferenciação de trilinhagem e FP-MSCs exibiu o potencial de diferenciação menos adipogica.
Em conclusão, os nossos resultados mostraram que a qualidade e quantidade de MSCs isoladas diferiu entre os quatro fontes na amostra de medula / placenta. CPJ-MSCs tinha mais capacidade de proliferação e maior potencial de auto-renovação. Eles também foram potentes na sua diferenciação em tipos de células de trilinhagem. Devido ao seu baixo tempo de duplicação, CPJ-MSC pode ser rapidamente expandido 1000 vezes e utilizadas para a droga de alto rendimento ou rastreio biomaterial. Essas células poderiam ser uma fonte mais promissora para a terapia celular e aplicações de medicina regenerativa.
The authors have nothing to disclose.
O estudo foi apoiado pela OU-WB ISCRM, Oakland University e Michigan Head and Spine Institute. N. Beeravolu e C. McKee recebeu o Prêmio de Pesquisa de Pós-Graduação Provost da Universidade de Oakland. Agradecemos S. Bakshi pela revisão do manuscrito.
DMEM with 4500 mg/ml glucose | Invitrogen | 11995065 | |
FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
Insulin | Prospec | CYT-270 | |
Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
DNase | Promega | M6101 | |
iScript kit | Biorad | 1708891 | |
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
Crystal violet | Sigma | C3886 | |
Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |