Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire
Summary
Une évaluation fonctionnelle de la jonction neuromusculaire (NMJ) peut fournir des informations essentielles sur la communication entre le muscle et le nerf. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer globalement les fonctionnalités NMJ tant musculaire à l’aide de deux préparations différentes muscle-nerf, c’est-à-dire soléaire-sciatique et diaphragme-phrénique.
Abstract
Fonctionnalité de la jonction neuromusculaire (NMJ) joue un rôle central dans l’étude des maladies dans lesquelles la communication entre les neurones moteurs et les muscles est altérée, comme le vieillissement et la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Nous décrivons ici un protocole expérimental qui peut être utilisé pour mesurer la fonctionnalité NMJ en combinant deux types de stimulation électrique : direct stimulation membrane musculaire et la stimulation du nerf. La comparaison de la réponse du muscle à ces deux stimulations différentes peut aider à définir, au niveau fonctionnel, les altérations éventuelles dans le NMJ qui conduisent à un déclin fonctionnel dans le muscle.
Préparationsx vivo E sont adaptées aux études bien contrôlées. Nous décrivons ici un protocole intensif pour mesurer plusieurs paramètres de muscle et de la fonctionnalité NMJ pour la préparation de nerf sciatique-soléaire et pour la préparation du nerf phrénique-diaphragme. Le protocole dure environ 60 minutes et est réalisé sans interruption au moyen d’une mesure logiciel qui mesure les propriétés cinétiques de contraction, la relation force-fréquence de stimulation musculaire et du système nerveux et deux paramètres spécifiques aux fonctionnalités de NMJ, c’est-à-dire la défaillance de la neurotransmission et la fatigue intratetanic. Cette méthodologie a été utilisée pour détecter des dommages dans les préparations de nerf-muscle soléaire et le diaphragme à l’aide de souris transgéniques SOD1G93A , un modèle expérimental de la SLA qui risque partout la mutant antioxydant enzyme superoxyde dismutase 1 (SOD1).
Introduction
La jonction neuromusculaire (NMJ) est une synapse chimique formée par la liaison entre la plaque de serrage moteur de la fibre musculaire et l’axone des motoneurones terminal. Le NMJ s’est avéré jouent un rôle crucial lorsque la communication entre le muscle et le nerf est altérée, comme le vieillissement ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Comme le muscle et le nerf communiquent en voie bidirectionnelle1,2, être capable de mesurer les défauts NMJ séparément des défauts de muscle peut apporter un nouvel éclairage sur leur interaction physiopathologique. En effet, cette évaluation fonctionnelle peut aider à déterminer si des altérations morphologiques ou biochimiques réduisent fonctionnalité de signalisation de la neurotransmission.
La comparaison de la réponse contractile musculaire provoquée par une stimulation nerveuse et la réponse du muscle même évoqué par stimulation directe de sa membrane a été proposée comme une mesure indirecte de la fonctionnalité NMJ. En effet, depuis la neurotransmission membrane stimulation de contournement de signalisation, toutes les différences dans les deux réponses contractiles peuvent être imputés à l’évolution de la NMJ. Cette approche a été largement proposée pour rats3,4,5,6,7et également utilisée pour recueillir des informations sur des souris modèles8,9,10,11,12.
Ici, nous décrivons en détail une procédure permettant d’accise et de tester deux préparations de muscle-nerf, i. e. les préparatifs du soléaire-sciatique et diaphragme-phrénique. À l’aide de fait à l’ordre logiciel, nous avons conçu un protocole d’analyse continu qui combine la mesure des différents paramètres qui caractérisent la fonctionnalité NMJ et le muscle, réduisant ainsi à une évaluation complète des dommages NMJ séparément de celui du muscle. En particulier, le protocole de mesure de la force de la contraction, la cinétique de muscle, la courbe force-fréquence direct et les stimulations nerveuses, l’ échec de neurotransmission13 pour une mise à feu et les fréquences tétaniques et la fatigue intratetanic7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole expérimental décrit ci-dessus est un moyen idéal de mesure et de discriminer les altérations fonctionnelles qui ont eu lieu directement dans le muscle ou indirectement au niveau de la jonction neuromusculaire. Étant donné que cette technique est basée sur une mesure indirecte de la fonctionnalité NMJ, il ne peut servir à établir si tout défaut est lié à des changements morphologiques ou de changements biochimiques. En revanche, il fournit un moyen efficace de déterminer si des modifications mor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Travail en laboratoire des auteurs a été pris en charge par Fondazione Roma et téléthon (subvention no. GGP14066).
Materials
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Potassium dihydrogen phosphate KH₂PO₄ | AnalaR | 7778-77-0 | |
| Magnesium sulphate MgSO₄ | AnalaR | 7487-88-9 | |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors – 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
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