Mäta neuromuskulära förbindelsen funktionalitet
Summary
En funktionell bedömning av den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) kan ge viktig information om kommunikationen mellan muskel och nerv. Här beskriver vi ett protokoll för att fullständigt utvärdera både NMJ och muskel funktionaliteten med hjälp av två olika muskel-nerv preparat, dvs soleus-ischiasnerven och membran-phrenic.
Abstract
Neuromuskulära förbindelsen (NMJ) funktionalitet spelar en nyckelroll när man studerar sjukdomar där kommunikationen mellan motor neuron och muskel är försämrad, till exempel åldrande och amyotrofisk lateralskleros (ALS). Här beskriver vi ett experimentellt protokoll som kan användas för att mäta NMJ funktionalitet genom att kombinera två typer av elektrisk stimulering: direkt membran muskelstimulering och stimulering genom nerv. Jämförelse av muskel svaret på dessa två olika stimuli kan hjälpa till att definiera, på den funktionella nivån, potentiella förändringar i NMJ som leder till funktionella nedgång i muskel.
Ex vivo preparat är lämpade för välkontrollerade studier. Här beskriver vi ett intensivt protokoll för att mäta flera parametrar för muskel och NMJ funktionalitet för soleus-ischias nerv beredning och för membran-phrenic nerv beredning. Protokollet varar ca 60 min och bedrivs oavbrutet genom en skräddarsydd programvara som mäter egenskaperna twitch kinetik, kraft-frekvens förhållandet för både muskel- och nerv stimuli och två parametrar som är specifika för NMJ funktionalitet, dvs neurotransmission misslyckande och intratetanic trötthet. Denna metod användes för att upptäcka skador i soleus och membranet muskel-nerv preparat med hjälp av SOD1G93A transgena möss, en experimentell modell av ALS som ubiquitously overexpresses den muterade antioxidant enzymet superoxiddismutas 1 (SOD1).
Introduction
Den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) är en kemisk synaps bildas av anslutningen mellan den motoriska endplate av muskelfibern och motorneuron axon terminal. NMJ har visat sig spela en avgörande roll när kommunikationen mellan muskler och nerver är nedsatt, som sker i åldrandet eller amyotrofisk lateralskleros (ALS). Som muskel- och nerv kommunicera i en dubbelriktad väg1,2, kan att kunna mäta NMJ defekter separat från muskel defekter ge nya insikter i deras physiopathological samspelet. Faktiskt, detta funktionell utvärdering kan hjälpa till att bedöma om morfologiska eller biokemiska förändringar minska neurotransmission signalering funktionalitet.
Jämförelse av muskel kontraktila svar framkallas av nervstimulering och respons av samma muskel frammanade av direkt stimulering av dess membran har föreslagits som en indirekt mätning av NMJ funktionalitet. Faktiskt, sedan membran stimulering av-passerar neurotransmission signalering, eventuella skillnader i två kontraktila Svaren kan tillskrivas förändringar i NMJ. Detta synsätt har i stor utsträckning föreslagits för råttor3,4,5,6,7, och också används för att samla information om mus modeller8,9,10,11,12.
Här beskriver vi i detalj en procedur för att punktskatt och testa två muskel-nerv preparat, i. e. soleus-ischiasnerven och membran-phrenic förberedelserna. Med en skräddarsydd programvara, vi utformade en kontinuerlig testning protokoll som kombinerar mätning av flera parametrar som kännetecknar både NMJ och muskel funktioner, därmed ger en omfattande utvärdering av NMJ skada separat från det av muskel. I synnerhet mäter protokollet kraften som twitch muskel kinetik, kraft-frekvenskurvan för direkt och nerv stimuli, neurotransmission misslyckande13 för både en bränning tetanic frekvenserna och den intratetanic trötthet7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det experimentellt protokoll som beskrivs ovan ger ett idealiskt sätt att mäta och diskriminera någon funktionella förändringar som har skett direkt i muskeln eller indirekt på neuromuskulära förbindelsen nivå. Eftersom denna teknik är baserad på en indirekt mätning av NMJ funktionalitet, kan inte det användas för att fastställa om defekter är relaterad till morfologiska förändringar eller biokemiska förändringar. Däremot ger den ett effektivt sätt att fastställa huruvida eventuella morfologiska el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbete i författarnas laboratorium stöddes av Fondazione Roma och Telethon (bevilja nr. GGP14066).
Materials
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Potassium dihydrogen phosphate KH₂PO₄ | AnalaR | 7778-77-0 | |
| Magnesium sulphate MgSO₄ | AnalaR | 7487-88-9 | |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors – 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. . Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
