Drosophila Bakım Davranışının Nicelleştirilmesi
Summary
Bu protokol, bakım davranışı ölçmek için sağlam, nicel veri üreten, Drosophila'daki ölçeklendirilebilir bireysel bakım tezgah tekniğini tanımlamaktadır. Yöntem, bakımsız ve bakımlı hayvanlar arasındaki boya birikimindeki farkın belirli bir süre boyunca karşılaştırılmasına dayanmaktadır.
Abstract
Drosophila tımar etme davranışı hem ön hem arka kıskaçların koordine hareketini gerektiren karmaşık, çok adımlı bir lokomotif programdır. Burada, damlama deneyi protokolünü ve Drosophila damatlaştırma konusundaki küçük ölçekli veya büyük ölçekli araştırmalar için uygun maliyetli ve ölçeklendirilebilir yeni oda tasarımı sunuyoruz. Sinekler Brilliant Yellow boya ile vücudun her tarafına tozlanır ve boya oda içindeki bedenlerinden uzaklaştırılması için zaman verilir. Sinekler daha sonra, boya çözündürmek için belirli bir hacimde etanol içine çöker. Dezenilmemiş hayvanlara kıyasla bakımsız hayvanlar için boya etanol numunelerinin göreceli spektral absorbansı ölçülür ve kaydedilir. Protokol, tek tek sinekler için boya birikiminin niceliksel verilerini verir; bunlar kolaylıkla ortalanabilir ve örnekler arasında karşılaştırılabilir. Bu, deneysel tasarımların mutant hayvan çalışmaları veya devre manipülasyonları için damat yeteneğini kolayca değerlendirmesini sağlar. Bu verimli prosedür çok yönlü ve ölçeklenebilir. WOrk akışını ve Drosophila tip I Dopamin Reseptörü ( DopR ) için WT hayvanları ve mutant hayvanlar arasındaki karşılaştırma verileri.
Introduction
Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) 'de tımarlama , birden fazla bağımsız motor programının koordinasyonunu içeren sağlam bir doğuştan gelen davranıştır 1 . Meyve, toz, mikrop ve diğer patojenler vücutlarını temizler; bu da, görme ve uçuş gibi normal fizyolojik fonksiyonları engelleyebilir veya önemli bağışıklık sorunlarına yol açabilir. Hem mekanik 2 hem de bağışıklık aktivasyonunu 3 algılar ve yanıt verirken, sinekler yeterli derecede temizleninceye ve vücudun bir başka bölümüne doğru ilerleyinceye kadar bacaklarını birlikte ya da hedeflenen bir vücut bölgesine tekrar ovarlar. Sinekler, kalıplaşmış desenler 1 , 4'te büyük oranda ortaya çıkan belirgin vuruşlarda tımar etme hareketleri gerçekleştirirler. Davranışsal bir hiyerarşi, tımar sinyalleri önceliklendirildiğinde ortaya çıkar. Etkinlik devreleri ve kalıpları;hiyerarşinin en üstünde tımar programlar sonradan 5 bakımlı vücut bölgelerinden paralel sinyallerini ilk oluşur ve bastırmak fa modeli. Başa en yüksek öncelik verilir, daha sonra karın, kanatlar ve nihayetinde toraks 5 verilir .
D. melanogaster'ın tımar programı, sinirsel devreleri, modüle edici moleküler sinyaller ve nörotransmitterleri incelemek için ideal bir sistemdir. Örneğin, nörofibromin fonksiyonunun 6 uzlaşılması, Drosophila kırılgan X zihinsel gerilik proteininin ( dfmrl ) 7 kaybı ve bisfenol A (BPA) 8'e maruz kalma, aşırı nevrofibromatozis , kırılgan X semptomlarına benzeyen aşırı bakımı ve diğer davranışlara neden olur Sendromu ve otistik spektrum bozukluklarının ve Dikkat Eksikliği Hiperaktivite Bozukluğunun (DEHB) yönlerini içerir. Bakım davranışı aynı zamanda habitua da olabilirBu motor programını davranışsal plastisite çalışmaları için ödünç alan mutant suşlar 2 boyunca farklı şekilde ölçülmüştür. Drosophila tarafından modellenebilen nörolojik olayların genişliği, sineklerin kendilerini damatlama yeteneğini ölçmek için yeni bir karşılaştırmalı yaklaşım gerektirir.
Vesiküler monoamin taşıyıcılarının ve vücudun içindeki diğer dopamin ve diğer biyojenik aminlerin bol miktarda biraraya getirilmesinin, meyve sineği tımar etme davranışına aracılık ettiği gösterildi 9 , 10 . Tiramin, oktopamin bir öncüsü, aynı zamanda daha az bir oranda 7 bakım tetikler oktopamin ve dopamin, başları sinekler karşılaştırılabilir Arka bacak bakım aktivitesini uyarır. D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14'te dört dopamin reseptörü tanımlanmıştır </sup>. Bu protokol açıklanan tımar tahlil yöntemi kullanarak, davranış 15 tımar Tip I ailesi Dopamin Reseptör DopR (dilsiz DopR, dDA1) Arka bacak içinde bir rol belirlendi.
Bakım dolaylı olarak, bir hayvanın tüm vücudu bir işaretleyici boya veya flüoresan tozu 5 , 16 ile tozladıktan sonra tamamen damat olabileceği temizlik derecesine bakarak nicelleştirilebilir. Vücutta kalan tozun geri kalanı genel davranış için göreceli bir işaretleyici olarak kullanılabilir. Damlamaya yetecek vakit verildikten sonra tozlu sinekler tımar davranışında belirgin bir eksikliği gösterebilirler. Tımar araştırmalar daha geniş olmak gibi, protokoller boyun bağ sinirler 10 üzerine farmakolojik tedaviler ekleme kafaları kesilmek gibi uygulamalar dahil olması, bakım yanıtı 2 ortaya çıkarmak için, kılların dokunsal uyarılmasıVe davranış video kaydı 15 . Tımar doğrudan gözlenmesi, kolaylıkla görsel gözlem ile ve elle belirli bakım etkinlikleri 4 süresini ve sıklığını kaydedilmesiyle incelenebilir.
Bir 3B yazıcı veya lazer kesici ile yapılabilecek on beş kuyu bakım odasını tasarladık ve üretim planı tasarımları üreme için hazırdır 15 . Tasarım, sırasıyla sinek ve / veya boya yüklü, örgü ve iki ek kayar üst ve alt plaka ile birbirine uyan açıklıklar olan iki birleştirilmiş merkezi plakalar kullanıyor. Toz haline getirilmiş sinekler damat kılmaya izin verdikten sonra, onları boya çözündürmek ve bu solüsyonun emiciliğini boyanın dalga boyunda ölçmek için etanolde bırakırız. Birden fazla paralel numune için bir plaka okuyucu kullanılabilir veya tekli numuneler için tekli okunur bir spektrofotometre kullanılabilir. Bu yöntem kullanım ve harekete geçirme hatalarını en aza indirir.Daha düşük, daha düşük maliyetli bir ölçekte yapılacak tımar testleri için düşükler. Bu yöntem, elde edilen ve sıcaklığa duyarlı devre manipülasyonlar için 5 ısıtma elemanları ile daha büyük bir bakım odaları kullanımı Julie Simpson ve Andrew tohumları, öncülük metotlardan modifiye edilmiştir. Aşağıdaki protokol, vücudun her bölümünde boya birikiminin nicelleştirilmesi için alternatif yöntemlerin yanı sıra, tüm vücut bakımlarının sayısallaştırılmasını gösterir. Ayrıca, WT ve DopR mutantları arasında örnek karşılaştırma verisinin yanı sıra bakım davranışı için basit bir performans indeksinin hesaplanması için yöntemler sunuyoruz .
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakım testi nispeten basittir, ancak deneyanları aşağıdaki hususlara özel dikkat etmeye özen göstereceğiz. Sinekler ve boyayı taktıktan sonra üst ve alt plakalardaki vidaları sıkarak sıkı bir sızdırmazlık korumak tekrarlanabilir sonuçlar için gereklidir. Parlak Sarı boya çok ince ve gevşek derzler odanın kenarlarından boya kaybına izin verecek. Her kuyu için boya içeriğindeki düzensizlik, tımar halindeki olaylar için varyasyon ve sahte pozitif oranları artıracak düzensiz tozlama gibi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu metodoloji ve oda tasarımlarını test etme ve tesis etme konusunda erken çalışmalar yapmak için Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon ve Rose Hedreen'e teşekkür etmek istiyoruz. Yazıyı okumak ve düzenlemek için Kelly Tellez ve Graham Buchan'a teşekkür ediyoruz. Andrew Toeds ve Julie Simpson'a öncü çalışmaları ve Brilliant Yellow Dye (Sigma) kullanımını önermek için verdikleri tavsiye ve destekleri nedeniyle teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen Mary E. Groff Cerrahi ve Tıbbi Araştırma ve Eğitim Yardım Kuruluşu Güvenliği, Bronfman Bilim Merkezi ve Hellman Fellows Programı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1ml and 200ul) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2" x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96 well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8-32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8-32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8-32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2-56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation – Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior–a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
