Cuantificación de la Drosophila Grooming Comportamiento
Summary
Este protocolo describe una técnica de ensayo escalable de aseo personal en Drosophila que proporciona datos robustos y cuantitativos para medir el comportamiento de la preparación. El método se basa en la comparación de la diferencia en la acumulación de colorantes en los cuerpos de los animales no ceñidos frente a los cuidados durante un período determinado de tiempo.
Abstract
El comportamiento de aseo de Drosophila es un complejo programa locomotor de varios pasos que requiere un movimiento coordinado tanto de las patas delanteras como de las patas posteriores. Aquí presentamos un protocolo de ensayo de aseo personal y un nuevo diseño de cámara que es rentable y escalable para estudios pequeños o en gran escala de aseo de Drosophila . Las moscas se espolvorean por todo su cuerpo con colorante amarillo brillante y se da tiempo para eliminar el tinte de sus cuerpos dentro de la cámara. Las moscas se depositan entonces en un volumen establecido de etanol para solubilizar el colorante. Se mide y se registra la absorbancia espectral relativa de muestras de tinte-etanol para animales cepillados frente a no cepillados. El protocolo proporciona datos cuantitativos de acumulación de colorantes para las moscas individuales, que pueden ser fácilmente promediados y comparados entre muestras. Esto permite que los diseños experimentales evalúen fácilmente la capacidad de preparación para estudios en animales mutantes o manipulaciones de circuitos. Este procedimiento eficiente es versátil y escalable. Mostramos wOrk-flow del protocolo y datos comparativos entre animales WT y animales mutantes para el Receptor de Dopamina Drosophila tipo I ( DopR ).
Introduction
El aseo en Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) es un comportamiento innato robusto que implica la coordinación de múltiples programas motores independientes 1 . Las moscas de la fruta limpian sus cuerpos de polvo, microbios y otros patógenos que podrían inhibir la función fisiológica normal, como la visión y el vuelo, o dar lugar a desafíos inmunológicos importantes. Al detectar y responder tanto a la mecánica 2 como a la activación inmunitaria 3 , las moscas se frotan repetidamente las piernas juntas o en una región del cuerpo objetivo hasta que esté suficientemente limpia y el aseo progrese hacia otra parte del cuerpo. Las moscas realizan movimientos de aseo en episodios distintos que ocurren en gran medida en patrones estereotipados 1 , 4 . Una jerarquía de comportamiento se hace evidente a medida que las señales de aseo se priorizan. Se han identificado circuitos y patrones de actividad paraFa que los programas de aseo en la parte superior de la jerarquía ocurren primero y suprimen las señales paralelas de las áreas del cuerpo que se preparan posteriormente 5 . La máxima prioridad se da a la cabeza, luego al abdomen, alas y finalmente al tórax 5 .
El programa de aseo en D. melanogaster es un sistema ideal para estudiar circuitos neuronales, señales moleculares moduladoras y neurotransmisores. Por ejemplo, el compromiso de la función de la neurofibromina 6 , la pérdida de la proteína de retraso mental X frágil de Drosophila ( dfmr1 ) 7 y la exposición al bisfenol A (BPA) 8 causan excesiva higiene y otros comportamientos análogos a los síntomas humanos discretos de neurofibromatosis, X frágil Síndrome y aspectos de los trastornos del espectro autista y trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH), respectivamente. El comportamiento de la preparación también puede ser habituaDiferenciadamente a través de las cepas mutantes 2 , otorgando este programa motor a estudios de plasticidad conductual. La amplitud de los fenómenos neurológicos que pueden ser modelados por Drosophila exige un nuevo enfoque comparativo para medir la capacidad de las moscas para prepararse.
La acción combinada de transportadores de monoaminas vesiculares y la abundancia relativa de la dopamina y otras aminas biogénicas en el cuerpo se ha demostrado que mediar mosca de la fruta comportamiento 9, 10 de la preparación. La octopamina y la dopamina estimulan la actividad comparativa de aseo de las patas traseras en las moscas decapitadas, mientras que la tiramina, precursora de la octopamina, también desencadena el aseo en menor grado 7 . Se han identificado cuatro receptores de dopamina en D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup>. Utilizando el método de ensayo de aseo descrito en este protocolo, se determinó un papel para la familia de Tipo I Dopamine Receptor DopR ( DopR, dDA1, tonto ) en el comportamiento de aseo de la espalda 15 .
El aseo se puede cuantificar indirectamente mirando el grado de limpieza por el cual un animal puede prepararse completamente después de limpiar el cuerpo entero con un tinte marcador o polvo fluorescente 5 , 16 . El resto de polvo que queda en el cuerpo puede usarse como un marcador relativo para el comportamiento general. Moscas polvorientas después de ser dado tiempo suficiente para el novio puede estar manifestando un déficit específico en el comportamiento de aseo. A medida que las investigaciones de aseo se han vuelto más extensas, los protocolos han incorporado prácticas tales como la decapitación para agregar tratamientos farmacológicos a los nervios conectivos del cuello 10 , estimulación táctil de cerdas para obtener la respuesta de aseo 2 ,Y grabación de vídeo de comportamiento 15 . La observación directa de la preparación puede ser fácilmente estudiada mediante el uso de la observación visual y el registro manual de la frecuencia y la duración de los eventos de aseo específicos 4 .
Diseñamos una cámara de preparación de quince pocillos que puede ser construida con una impresora 3D o cortador láser, y los diseños de planos están disponibles para su reproducción 15 . El diseño utiliza dos placas centrales unidas con aberturas emparejadas y separadas por malla y dos placas deslizantes superiores y inferiores adicionales, de las cuales se cargan moscas y / o tintes, respectivamente. Después de permitir que las moscas espolvoreadas se preparen, se depositan en etanol para solubilizar el colorante y se mide la absorbancia de esta solución a la longitud de onda del colorante. Se puede utilizar un lector de placas para múltiples muestras paralelas o un espectrofotómetro de lectura única para muestras individuales. Este método minimiza el error inducido por la manipulación yBajos para los ensayos de aseo para funcionar en una escala más pequeña y rentable. Este método se deriva y se modifica a partir de los métodos pioneros de Julie Simpson y Andrew Seeds, que utilizan cámaras de grooming más grandes con elementos de calefacción para la temperatura de manipulación de circuitos sensibles [ 5] . El siguiente protocolo muestra la cuantificación de la preparación de todo el cuerpo, así como muestra métodos alternativos para la cuantificación de la acumulación de tinte en partes del cuerpo individuales. También se presentan los datos de comparación de muestras entre WT y DopR mutantes, así como los métodos para calcular un índice de rendimiento simple para el comportamiento de aseo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de aseo es relativamente sencillo, pero recomendamos a los experimentadores que presten especial atención a los siguientes temas. Mantener un sello hermético apretando los tornillos en las placas superiores e inferiores después de introducir las moscas y el tinte es esencial para resultados reproducibles. El colorante Brilliant Yellow es muy fino y las articulaciones sueltas permitirán pérdidas de colorante de los bordes de la cámara. La irregularidad en el contenido de colorante para cada pocillo podrí…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deseamos agradecer a Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon y Rose Hedreen por sus primeros trabajos en pruebas y establecimiento de esta metodología y diseños de cámara. Agradecemos a Kelly Tellez y Graham Buchan por leer y editar el manuscrito. Damos las gracias a Andrew Seeds y Julie Simpson por su trabajo pionero y su asesoramiento y apoyo en la sugerencia del uso de Brilliant Yellow Dye (Sigma). Este trabajo es apoyado en parte por el Mary E. Groff Cirugía y Investigación Médica y Educación Charitable Trust, el Bronfman Science Center, y el Hellman Fellows Program.
Materials
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1ml and 200ul) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2" x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96 well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8-32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8-32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8-32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2-56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
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