MitoCeption: Overføre isolert human MSC Mitokondrier å glioblastom stamceller

Summary

Her er en protokoll (MitoCeption) present å overføre mitokondriene, isolert fra humane stamceller (MSC), til glioblastom stamceller (GSC), med mål om å studere deres biologiske effekter på GSC metabolisme og funksjoner. En lignende protokoll kan tilpasses til å overføre mitokondriene mellom andre celletyper.

Abstract

Mitokondrier spiller en sentral rolle for celle metabolisme, energiproduksjon og kontroll av apoptose. Utilstrekkelig mitokondriefunksjon har blitt funnet ansvarlig for meget forskjellige sykdommer, som strekker seg fra neurologiske sykdomstilstander til kreft. Interessant, mitokondrier har nylig blitt vist å vise evne til å bli overført mellom celletyper, særlig fra humane stamceller (MSC) til kreftceller i coculture forhold, med metabolske og funksjonelle konsekvenser for mitokondriene mottakercellene, noe som ytterligere forbedrer den aktuelle for de biologiske egenskapene til disse organeller.

Evaluere effekten av det overførte MSC mitokondriene i målcellene er av primær betydning for å forstå den biologiske resultatet av slike celle-celle interaksjoner. Den MitoCeption Protokollen er beskrevet her muliggjør overføringen av mitokondriene isolert på forhånd fra donorcellene til målcellene, ved hjelp av MSC mitokondrierog glioblastom stamceller (GSC) som et modellsystem. Denne protokollen har tidligere vært brukt til å overføre mitokondriene, isolert fra MSC, til adherente MDA-MB-231 kreftceller. Dette mitokondrier overføringsprotokoll er tilpasset her for GSCs som presenterer den spesifikke spesielle ved vokser som neurosfærer in vitro. Overføringen av de isolerte mitokondrier kan etterfølges av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) og konfokal avbildning ved hjelp mitokondrier vitale fargestoffer. Bruken av mitokondrier donor og målceller med forskjellige haplotyper (SNPs) muliggjør også påvisning av de overførte mitokondriene basert på konsentrasjonen av deres sirkulære mitokondrie DNA (mtDNA) i målcellene. Når protokollen har blitt validert med disse kriteriene, kan de celler som de overførte mitokondriene bli ytterligere analysert for å bestemme virkningene av eksogene mitokondrier på biologiske egenskaper slik som cellemetabolisme, plastisitet, proliferasjon og respons på behandling.

Introduction

Mitokondrier er organeller som finnes i eukaryote celler der de spiller en sentral rolle i næringsopptak, samt i energi og metabolitt produksjon. Disse organeller inneholde sirkulært mitokondrie DNA (mtDNA), 16,6 kb langt, som koder for proteiner av elektrontransportkjeden komplekser, tRNA og rRNAs ^1. Funksjonaliteten av disse organeller er kritisk for celle homeostase og flere patologier som er forbundet med mitokondrier dysfunksjon ^{1, 2, 3.} Mitokondriene status er for eksempel blitt koblet til betennelse, infeksjonssykdommer og kreft, i dette sistnevnte tilfellet med konsekvenser for metastasering og motstand mot terapi ^{4, 5, 6, 7.}

Mitokondrier vise bemerkelsesverdig kapasitet bli overført mellom "donor" og "mål" celler. Dette fører til endringer i den energetiske metabolismen av målcellene, så vel som i andre funksjonelle modifikasjoner som vevsreparasjon og motstand mot kjemoterapeutiske midler, som nylig vist ved forskjellige laboratorier ^{8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16.} De humane stamceller (MSC) for å vise denne evne til å overføre mitokondriene til et bredt utvalg av målceller, inkludert kardiomyocytter, endotelceller, pulmonare alveolare epitelceller, renale tubulære celler og kreftceller, som fører til modifikasjoner av de funksjonelle egenskapene til disse cellene ^8,> ^{9, 10, 12, 17, 18.}

Mitokondrier utveksling fremstår nå som en mye brukt mekanisme som gjør at en rekke forskjellige celletyper for å kommunisere med hverandre og modifisere deres biologiske egenskaper. Dette mitokondrier utveksling kan skje gjennom tunneling nanorør (TNT) formasjon, som involverer connexin 43-holdige gap veikryss ⁸ eller M-Sec / TNFaip2 og exocyst komplekse ^19. Alternativt mitokondriene overføringen ble også vist å være formidlet av arrestin domene-inneholdende protein 1-medierte mikrovesikler (ARMMs) ^20. Interessant nok var effekten av mitokondriene overføring knyttet til uttrykket hastigheten av Rho GTPase en MIRO1 ^21, en nøkkelfaktor for å forklare forskjellene i mitokondriene overførings efficacies mellom iPSC-MSC og voksen BM-MSC ^22.

Til tross for denne enorme mengder data om celle-til-celle-mitochondria utveksling, er forholdsvis lite kjent om den metabolske og biologisk resultat av dette mitokondrier overføringen. Derfor det fullt garanterer å sette opp de riktige verktøyene for å vurdere biologiske effekter av denne overføringen fullt. Gjennom årene har flere tekniske tilnærminger overføre mitokondrier fra donor til akseptor-celler har vært foreslått. Dette omfatter direkte injeksjon av mitokondrier i oocytter ^{23, 24, 25,} cellefusjon for å generere transmitochondrial cybrids ^{26, 27} og, mer nylig, overføring av isolerte mitokondrier som bruker fototermiske nanoblades ^28.

Vi og andre tidligere vist kapasiteten av isolert mitochondria å bli internalisert av levende celler, som observert både in vitro og in vivo ^{29, 30, 31,} gjennom mekanismer foreslått å involvere macropinocytosis ^32. Vi utviklet ytterligere en fremgangsmåte, kalt MitoCeption, til kvantitativt å overføre isolerte mitokondrier (fra MSC) til målceller, som eksemplifisert med (adherente) MDA-MB-231 brystkreftcellelinje ^31. Denne protokollen ble tilpasset her for overføring av isolerte humane MSC mitokondriene til glioblastoma stamceller (GSCs).

Glioblastom er aggressive maligne svulster i hjernen som raskt blir resistente mot behandling, hovedsakelig på grunn av glioblastom stamceller (GSC) til stede i svulsten ^33. Disse GSCs vokse som neurosfærer in vitro og generere tumorer i xenograft-modeller. Kreftceller innenfor glioblastom harkapasitet til å gjøre celle-til-celle-forbindelser, slik som vist nylig for astrocytic hjernetumorceller som sammenkoblings via utvidet mikrorør, gjennom hvilke mitokondrier (så vel som kalsium- og cellekjerner) kan migrere, noe som resulterer i radioterapi fast astrocytom nettverk ^34. Glioblastom kan rekruttere mange forskjellige celler i tumoren mikromiljøet, inkludert MSC ^{35, 36.} Vi viste at MSC kan gjøre celle-celle forbindelser med GSCs i coculture og overføre sine mitokondrier (data ikke vist), noe som forventes å endre GSC funksjonelle egenskaper. Den nåværende protokollen beskriver hvordan MitoCeption teknikken kan brukes til å overføre mitokondriene, isolert på forhånd fra menneskelige MSC, menneskelige GSCs med det formål å bestemme deres funksjonelle biologiske utfallet. Den multipotent og svært tumorgene GB4 GSC linje ³⁷ ble anvendt i denne studien.

Protocol

Dag 1 1. Merking av Mesenchymale Stem Cell (MSC) Mitokondrier (valgfritt) To dager før den mitokondriene fremstillingen, frø humane MSC i en 100 mm kulturskål, i 10 ml aMEM / FBS 10%, slik som å ha 4 x 10 5 MSC i kultur på dag en. Skyll MSC med PBS (4 ml) og tilsett 4 ml aMEM / FBS 1% (forvarmet til 37 ° C). Legge til den nødvendige mengde av mitokondrier vitale fargestoff og inkubere cellene i 30 min i 37 ° C inkubator. Fjern mitokond…

Representative Results

De prosedyretrinn som beskriver isolering av mitokondrier fra mesenchymale stamceller (MSC) og deres overføring til de målrettede glioblastoma stamceller (GSC) ved MitoCeption er vist i figur 1. GSCs er kreftstamceller dyrket som Neurosfærene å bevare sine stamcelleegenskaper. For protokollen, GSCs sådd som enkeltceller et par timer før overføring av mitochondria (trinn 3) for å tillate høyere mitokondrier overføringseffektivitet (se FACS data figur 3B)…

Discussion

Et økende antall studier viser at cellene kan utveksle mitokondrier og at disse mitokondriene har dyptgripende virkninger på målcellen metabolisme og funksjoner. Derfor er det vesentlig å beherske verktøy til kvantitativt å overføre mitokondrier fra donorcellene på disse målcellene for å muliggjøre en nøyaktig undersøkelse av deres biologiske virkninger.

Protokollen er beskrevet her var opprinnelig utarbeidet for å overføre mitochondria isolert fra humane stamceller til tilhen…

Materials

Mitochondria Isolation Kit for Tissue	Fisher Scientific	10579663
N-2 Supplement (100X)	Fisher Scientific	11520536
B-27 Supplement W/O VIT A (50X)	Fisher Scientific	11500446
HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+	Sigma	H4385
poly Heme	Sigma	P3932
aMEM w/o glutamine	Ozyme	BE12-169F
DMEM/F-12 without glutamine,	Fisher Scientific	11540566
L-Glutamine	Invitrogen	25030-024
Glucose	Sigma	G7021
Insuline	Sigma	I 1882
Human bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Heparin	Sigma	H3149
CaCl2	MERCK	2382
Trypsine Inhibitor	Sigma	T9003
DNase I	SIGMA	10104159001
Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM	Invitrogen	25200056
Trypsin	Gibco	15090-046
Protease inhibitors EDTA free	Sigma	4693159001
Ciprofloxacine	Sigma	17850-5G-F
Fungine	Invivogen	ant-fn-1
Fungizone	Thermofisher	15290018
Gentamycin	Euromedex	EU0410
MitoTracker Green FM	Molecular Probes	M7514
MitoTracker Red CMXRos	Molecular Probes	M7512
MitoTracker Deep Red FM	Molecular Probes	M22426
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C7025
CellTracker Blue CMF2HC	Molecular Probes	C12881
RIPA	Santa Cruz	sc-24948
FluoroDish Sterile Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110
FACS tubes	Beckman Coulter	2,523,749
FACS apparatus	Gallios	3L 10C
LC FAST START DNA MASTER PLUS	Roche	3515885001