MitoCeption: Transferencia hermoso humano MSC mitocondrias de las células madre de glioblastoma

Summary

Aquí, un protocolo (MitoCeption) se presenta para transferir las mitocondrias, aislado a partir de células madre mesenquimatosas humanas (MSC), a las células madre glioblastoma (GSC), con el objetivo de estudiar sus efectos biológicos sobre el metabolismo y funciones GSC. Un protocolo similar se puede adaptar para transferir mitocondrias entre otros tipos de células.

Abstract

Las mitocondrias juegan un papel central para el metabolismo celular, la producción de energía y el control de la apoptosis. la función mitocondrial inadecuada ha sido encontrado responsable de muy diversas enfermedades, que van desde patologías neurológicas al cáncer. Curiosamente, las mitocondrias recientemente se ha demostrado para mostrar la capacidad de ser transferido entre los tipos de células, en particular a partir de células madre mesenquimatosas humanas (MSC) a las células cancerosas en condiciones de cocultivo, con metabólicos y funcionales consecuencias para las células mitocondrias receptores, mejorando aún más el interés actual para las propiedades biológicas de estos orgánulos.

La evaluación de los efectos de la mitocondria MSC transferido en las células diana es de primordial importancia para entender el resultado biológico de tales interacciones célula-célula. El protocolo MitoCeption descrito aquí permite la transferencia de las mitocondrias aisladas de antemano a partir de las células del donante a las células diana, usando MSC mitocondriasy células madre de glioblastoma (GSC) como un sistema modelo. Este protocolo se ha utilizado anteriormente para transferir las mitocondrias, aislado de MSCs, a adherente células cancerosas MDA-MB-231. Este protocolo de transferencia de las mitocondrias está adaptado aquí para GSCS que presentan la particularidad específica de crecer como neuroesferas in vitro. La transferencia de las mitocondrias aisladas puede ir seguida de células activadas por fluorescencia (FACS) y la imagen confocal utilizando mitocondrias colorantes vitales. El uso de células donantes y de destino mitocondrias con haplotipos distintos (SNP) también permite la detección de la mitocondria transferidos sobre la base de la concentración de su ADN mitocondrial circular (ADNmt) en las células diana. Una vez que el protocolo ha sido validado con estos criterios, las células que albergan la mitocondria transferidos se pueden analizar adicionalmente para determinar los efectos de las mitocondrias exógenos en las propiedades biológicas, tales como el metabolismo celular, la plasticidad, la proliferación y respuesta al tratamiento.

Introduction

Las mitocondrias son orgánulos que se encuentran en las células eucariotas en los que juegan un papel central en la absorción de nutrientes, así como en la producción de energía y metabolitos. Estos orgánulos contienen ADN mitocondrial circular (mtDNA), 16,6 kb de largo, que codifica las proteínas de los complejos de la cadena de transporte de electrones, tRNAs y rRNAs ^1. La funcionalidad de estos orgánulos es crítica para la homeostasis celular y varias patologías se han asociado con disfunción mitocondrias ^{1, 2, 3.} El estado de las mitocondrias, por ejemplo, ha sido relacionado con la inflamación, las enfermedades infecciosas y el cáncer, en este último caso con consecuencias para la metástasis y la resistencia a la terapia de ^{4, 5, 6, 7.}

Las mitocondrias muestran la notable capacidad de las siendo transferido entre las células "diana" "donante" y. Esto conduce a cambios en el metabolismo energético de las células diana, así como en otras modificaciones funcionales, tales como la reparación de tejidos y la resistencia a los agentes quimioterapéuticos, como demostrado recientemente por diferentes laboratorios ^{8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16.} Las células madre mesenquimales humanas (MSCs) muestran esta capacidad de transferencia de las mitocondrias a una amplia variedad de células diana, incluyendo cardiomiocitos, células endoteliales, células epiteliales alveolares pulmonares, células tubulares renales y las células cancerosas, lo que lleva a las modificaciones de las propiedades funcionales de estas células ^8,> ^{9, 10, 12, 17, 18.}

Las mitocondrias de cambio aparece ahora como un mecanismo ampliamente utilizado que permite que un número de diferentes tipos de células para comunicarse unos con otros y modificar sus propiedades biológicas. Este intercambio mitocondria puede ocurrir a través de la formación de los nanotubos de efecto túnel (TNT), con la participación de conexina 43 que contienen uniones gap ⁸ o M-Sec / TNFaip2 y la exocyst complejas ^19. Alternativamente, la transferencia de las mitocondrias también ha demostrado ser mediada por arrestina microvesículas proteína que contiene el dominio 1 (mediadas por ARMMs) ^20. Curiosamente, la eficacia de la transferencia de las mitocondrias estaba vinculada a la tasa de expresión de la Rho GTPasa 1 miro1 ^21, un factor clave para explicar las diferencias en las eficacias de transferencia entre las mitocondrias iPSC-MSC y adultos BM-MSC ^22.

A pesar de esta gran cantidad de datos relativos a las mitocondrias de cambio de célula a célula, se sabe relativamente poco sobre el metabolismo y la evolución biológica de esta transferencia de las mitocondrias. Por lo tanto, completamente de acuerdo con la configuración de las herramientas apropiadas para evaluar plenamente los efectos biológicos de esta transferencia. A través de los años, varios enfoques técnicos para la transferencia de las mitocondrias de donante a las células aceptoras se han propuesto. Esto incluye la inyección directa de las mitocondrias en oocitos de ^{23, 24, 25,} la fusión celular para generar cíbridos transmitochondrial ^{26, 27} y, más recientemente, la transferencia de mitocondrias aisladas utilizando fototérmica nanoblades ^28.

Nosotros y otros previamente demostrada la capacidad de mitochond aisladoria para ser internalizado por las células vivas, como se observa tanto in vitro como in vivo ^{29, 30, 31,} a través de los mecanismos propuestos para involucrar a macropinocitosis ^32. Hemos desarrollado además un método, llamado MitoCeption, para transferir cuantitativamente mitocondrias aisladas (de MSCs) a las células diana, como se ejemplifica con el (adherente) MDA-MB-231 línea celular de cáncer de mama ^31. Este protocolo fue adaptado aquí para la transferencia de las mitocondrias aisladas MSC humanos a las células madre de glioblastoma (GSCS).

Glioblastoma son tumores malignos agresivos del cerebro que rápidamente se vuelven resistentes al tratamiento, debido principalmente a las células madre glioblastoma (GSC) presentes dentro del tumor ^33. Estos GSCs crecen como neuroesferas en vitro y generan tumores en modelos de xenoinjerto. Las células cancerosas dentro de glioblastoma tienen lacapacidad para hacer conexiones de célula a célula, como se muestra recientemente para células tumorales cerebrales astrocíticos que se interconectan a través de microtubos extendidos, a través del cual las mitocondrias (así como núcleos de calcio y de células) pueden migrar, lo que resulta en las redes de astrocitoma de radioterapia resistente ^34. Glioblastoma puede reclutar muchas células diferentes dentro del microambiente del tumor, incluyendo MSCs ^{35, 36.} Nos mostró que las MSC puede realizar conexiones entre células con GSCS en co-cultivo y transferir sus mitocondrias (datos no mostrados), que se espera para modificar las propiedades funcionales de la SGC. El presente protocolo describe cómo la técnica MitoCeption se puede utilizar para transferir las mitocondrias, de antemano aislada de MSC humanas, a GSCs humanos con el propósito de determinar su resultado biológico funcional. El multipotentes y altamente tumorigénico línea Gb4 GSC ³⁷ se utilizó en este estudio.

Protocol

Día 1 1. El etiquetado de la célula madre mesenquimales (MSC) Las mitocondrias (Opcional) Dos días antes de la preparación mitocondrias, semilla de MSC humanas en una placa de cultivo de 100 mm, en 10 ml aMEM / FBS 10%, a fin de tener 4 x 10 5 MSCs en cultivo en el Día 1. Enjuagar las MSC con PBS (4 ml) y añadir 4 ml aMEM / FBS al 1% (precalentado a 37 ° C). Añadir la cantidad requerida de las mitocondrias colorante vital e incubar las células …

Representative Results

Los pasos de procedimiento que describen el aislamiento de las mitocondrias de las células madre mesenquimales (MSC) y su transferencia a las células madre glioblastoma dirigidos (GSC) por MitoCeption se muestran en la Figura 1. GSCS son las células madre cancerosas cultivadas como neuroesferas para preservar sus propiedades de células madre. Para el protocolo, GSCS se siembran como células individuales de un par de horas antes de la transferencia de las mitocondria…

Discussion

Un creciente número de estudios muestran que las células pueden intercambiar las mitocondrias y que estas mitocondrias tener profundos efectos en el metabolismo y las funciones de la célula diana. Por lo tanto, es esencial para dominar las herramientas para transferir cuantitativamente la mitocondria de las células del donante a estas células diana para permitir un estudio preciso de sus efectos biológicos.

El protocolo descrito aquí fue originalmente funcionó para transferir las mit…

Materials

Mitochondria Isolation Kit for Tissue	Fisher Scientific	10579663
N-2 Supplement (100X)	Fisher Scientific	11520536
B-27 Supplement W/O VIT A (50X)	Fisher Scientific	11500446
HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+	Sigma	H4385
poly Heme	Sigma	P3932
aMEM w/o glutamine	Ozyme	BE12-169F
DMEM/F-12 without glutamine,	Fisher Scientific	11540566
L-Glutamine	Invitrogen	25030-024
Glucose	Sigma	G7021
Insuline	Sigma	I 1882
Human bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Heparin	Sigma	H3149
CaCl2	MERCK	2382
Trypsine Inhibitor	Sigma	T9003
DNase I	SIGMA	10104159001
Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM	Invitrogen	25200056
Trypsin	Gibco	15090-046
Protease inhibitors EDTA free	Sigma	4693159001
Ciprofloxacine	Sigma	17850-5G-F
Fungine	Invivogen	ant-fn-1
Fungizone	Thermofisher	15290018
Gentamycin	Euromedex	EU0410
MitoTracker Green FM	Molecular Probes	M7514
MitoTracker Red CMXRos	Molecular Probes	M7512
MitoTracker Deep Red FM	Molecular Probes	M22426
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C7025
CellTracker Blue CMF2HC	Molecular Probes	C12881
RIPA	Santa Cruz	sc-24948
FluoroDish Sterile Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110
FACS tubes	Beckman Coulter	2,523,749
FACS apparatus	Gallios	3L 10C
LC FAST START DNA MASTER PLUS	Roche	3515885001