Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen
Summary
Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.
Abstract
Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.
Introduction
Mitochondriale bioenergetica en respiratoire capaciteit kan worden onderzocht niet alleen gepermeabiliseerde cellen of vezels, maar ook in geïsoleerde mitochondriën. In de huidige studie beschrijven we een protocol om intact skeletspieren mitochondriën met behulp van differentiële centrifugatie voor hoge-resolutie respirometrie metingen te isoleren.
Intact mitochondria isoleren respirometrie, het weefsel gehomogeniseerd en mitochondria geïsoleerd door differentiële centrifugatie gebruikelijke methode. De differentiële centrifugatie methode waarbij in de centrifugaties (in een reeks van toenemende snelheid) weefsel homogenaten werd eerst geïntroduceerd door Pallade en medewerkers bijna 70 jaar geleden 1. Het weefsel wordt eerst fijngehakt met een schaar en mechanisch gehomogeniseerd in een glazen homogenisator met een loszittende stamper. Daarna het homogenaat wordt gecentrifugeerd bij lage snelheid en de resulterende pellet die ononderbroken weefsel bevat, cellulairepuin en kernen wordt weggegooid. Vervolgens wordt de bovenstaande vloeistof meerdere malen gecentrifugeerd bij hoge snelheid en de mitochondriale verrijkte fractie wordt verzameld. De voordelen van de differentiële centrifugatie methode voor het isoleren mitochondria dat: i) de werkwijze is snel en mitochondria kunnen worden geïsoleerd binnen 1-1,5 uur (respiratoire experimenten worden uitgevoerd zo snel mogelijk); ii) het is goedkoop; en iii) het is zeer efficiënt en verkregen door differentiële centrifugatie mitochondria zuiver genoeg voor respirometrie assays. De nadelen van differentiële centrifugatie methode voor het isoleren mitochondria zijn dat i) mitochondriën kunnen beschadigd raken en ontkoppeld tijdens homogenisering; ii) de verontreiniging van mitochondriën met andere cellulaire componenten (kan worden opgelost door verder wassen van het mitochondriale pellet extra centrifugatiestappen); iii) de mogelijkheid tot het selecteren van verschillende mitochondriale subpopulaties, bijvoorbeeld tijdens differentiële centrifugering stappen, mitochondria met lagere dichtheid kan worden uitgesloten 7; en iv) de cellulaire mitochondriale omringende ontbreekt en alleen de theoretische maximale ademhaling kan worden gemeten. Een andere werkwijze voor mitochondria isoleren respirometrie assays is de dichtheidsgradiënt centrifugatie 2. In deze techniek wordt het weefsel extract gelaagd over een oplossing van sucrose of een Percoll gradiënt (met hogere dichtheid op de bodem van de centrifugebuis) en gecentrifugeerd bij een bepaalde snelheid, waardoor de mitochondriën te isoleren uit andere cellulaire componenten op basis van hun dichtheden. Deze werkwijze wordt vaak gebruikt om de hersenen mitochondriën geïsoleerd met zeer lage verontreiniging uit synaptosomen. Echter, de rattenlever mitochondriën geïsoleerd door dichtheidsgradiënt centrifugatie sterk verontreinigd met andere cellulaire organellen 3. Een van de beperkingen van deze methode is dat de sucrosegradiënt in de centrifugebuis zo kan scheurenme mitochondria (osmotische shock).
Afhankelijk van het type weefsel; er enkele belangrijke factoren te overwegen voor de isolatie van intacte mitochondriën door differentiële centrifugatie. Allereerst moet weefsels homogeniseren op een zachte manier. Zachte weefsels zoals de nieren, de hersenen en lever nodig zachte mechanische krachten die tijdens homogenisering. Dit in tegenstelling tot harde weefsels zoals hart en skeletspier sterker mechanische krachten vereisen. Gehakt weefsel wordt gewoonlijk behandeld met proteinase vóór de homogenisatie om het weefsel te verzachten. Alle buffers tijdens homogenisatie en centrifugatie moet ijskoud zijn en een fysiologisch relevante pH met een ionische sterkte en osmotische geschikt cytosol 4, 5.
Een van de voordelen van het bestuderen geïsoleerd mitochondriale bioenergetica dat cellulaire plasmamembranen hoeft te zijn permeabiseerd met detergentia zoals digitonine en saponine 4, 6, waarbij de buitenste mitochondriale membraan integriteit in gevaar kan brengen. Een ander voordeel van de geïsoleerde mitochondria is de afwezigheid van andere cytosolische factoren, die kunnen interfereren met de analyse van de mitochondriële functies zoals zuurstofconsumptie. De nadelen van het gebruik van de geïsoleerde mitochondriën de mogelijke selectie van bepaalde mitochondriale populatie tijdens de centrifugatiestappen, schade aan de mitochondriën tijdens homogenisatie, en het vereiste van grote hoeveelheden biologische monsters om een goede opbrengst van geïsoleerde mitochondria 7, 8 te verkrijgen.
Na de isolatie procedure, de luchtwegen tarieven van de mitochondriale complexen I, II en IV-afhankelijke (staten 2, 3 en 4) worden bepaald met behulp van hoge-resolutie respirometrie. Voor complexe innovatie aangestuurde ademhaling, glutamaaten malaat worden toegevoegd, gevolgd door adenosine difosfaat (ADP). Voor complexe II aangedreven ademhaling, succinaat wordt toegevoegd gevolgd door ADP. Voor complexe IV aangedreven ademhaling, ascorbaat en tetramethylphenylendiamine (TMPD) worden toegevoegd gevolgd door ADP 9, 10, 11, 12. State 2 verwijst naar zuurstofverbruik in aanwezigheid van alleen substraten. State 3 verwijst naar zuurstofverbruik in aanwezigheid van substraten en ADP. Staat 4 verwijst naar het zuurstofverbruik na ADP uitputting. De respiratoire controle ratio (RCR) is een index van koppeling van zuurstofverbruik ATP productie wordt berekend als de verhouding tussen toestand 3 en 4 staat 13, 15.
Samengevat beschrijven we een protocol om functionele en intacte skeletspier mitochondria geïsoleerd door differentiële centrifugatie en gebruikt deze geïsoleerde mitochonDria voor functionele en bio-energetische studies zoals hoge-resolutie respirometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie beschrijven we een protocol van hoge kwaliteit, intact en nauw verbonden skeletspier mitochondria door differentieel centrifugeren kan worden gebruikt voor functionele studies zoals hoge-resolutie respirometrie isoleren.
Om intact en nauw verbonden mitochondria isoleren, zijn er enkele kritische punten in het onderhavige protocol te worden beschouwd. Na het oogsten van het skelet weefsel moet meteen ondergedompeld in ijskoude mitochondriale isolatiebuffer. Alle centrifugatie s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).
Materials
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
References
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).
- Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics. 3, (2002).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).
- Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).
- Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
- Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).
