Summary

Entwicklung des Nervenreflextests in neonatalen Ratten Pups

Published: April 24, 2017
doi:

Summary

Verhaltenstests sind der Goldstandard für die Ergebnisse nach Gehirnverletzung zu bestimmen und können das Vorhandensein von Entwicklungsstörungen bei Säuglingen und Kindern identifizieren. Die Entwicklung des Nervenreflex ist ein Frühindikator dieser Anomalien. Eine Vielzahl von leicht erreicht Entwicklungs Reflex-Tests in den Neugeborenen-Nagetier wurden hier entwickelt und beschrieben.

Abstract

Der Entwicklung des Nervenreflex Tests in der klinischen Praxis zu bewerten die Reifung des Nervensystems verwendet. Die Entwicklung des Nervenreflex wird auch als primitive Reflexe bezeichnet. Sie sind empfindlich und im Einklang mit dem späteren Ergebnissen. Abnormal Reflexe als Abwesenheit, Persistenz, Wiedererscheinen oder Latenz von Reflexen beschrieben, die prädiktive Indizes von Säuglingen sind, die für die Entwicklung des Nervenstörungen mit hohem Risiko sind. Tiermodelle von der Entwicklung des Nerven Behinderungen, wie Zerebralparese, zeigen oft abweichende Entwicklungs Reflexe, wie bei menschlichen Säuglingen beobachtet werden würde. Die beschriebenen Techniken bewerten eine Vielzahl von der Entwicklung des Nervenreflexe bei neugeborenen Ratten. Die Entwicklung des Nervenreflextest bietet den Forscher ein Testverfahren, die sonst nicht in so jungen Tieren. Die Methodik präsentierte hier soll die Ermittler unterstützen, Entwicklungsmeilensteine ​​in neonatalen Ratten als ein Verfahren zum Nachweis früh einsetzenden br Prüfungain Verletzungen und / oder die Wirksamkeit von therapeutischen Interventionen zu bestimmen. Die Methodik präsentierte hier soll einen allgemeinen Leitfaden für Forscher zur Verfügung zu stellen.

Introduction

Entwicklung des Nervenreflexe oder Meilensteine ​​der Entwicklung sind eine der frühesten Bewertungen, die auf menschlichen Neugeborenen verwendet und Kleinkinder. Neurologische Reflexe sind unwillkürliche Bewegungen und sich wiederholende, der Hirnstamm und Rückenmark Reflexe zeigen. Reifung der höheren kortikaler Netze durch mich entwickelnden Migration, Myelinisierung gekennzeichnet, Synaptogenese und fördert freiwillige Kontrolle und kortikale Hemmung. Veränderungen im normalen Verlauf des zentralen Nervensystems Entwicklung kann die Entwicklung des Gehirns stören, in abnorme kortikale Verdrahtung führt, das Funktionieren und die Myelinisierung der Entwicklung des Nervenreflex Verzögerungen oder Fehlzeiten verursacht. Menschliche Säuglinge mit hohem Risiko für Entwicklung des Nerven Behinderung zeigen häufig abnormal frühen Reflexe. Abnormal Reflexe können als Verzögerung bei der Akquisition präsentieren, Abwesenheit, verlängerte Anwesenheit oder Wiedererscheinen später im Leben und sind prädiktiv für Entwicklungsstörungen. 1, 2 DeshalbIst es wichtig, Reflex Verzögerungen bei experimentellen Modellen der Entwicklung des Nervensystems Behinderungen zu imitieren.

Nagetiere sind als experimentelle Modelle angewendet. Junge Ratten sind altricial wenn geboren, und deshalb zu unreif spezifischen oder komplexen motorischen, sensorischen und / oder kognitive Verhaltens Aufgaben zu übernehmen. In diesem Zusammenhang bezieht sich ihre Entwicklungs Unreife sowohl ihre physischen und Organentwicklung. Die Ratten werden geboren haarlos mit einer Unfähigkeit zu temperieren, sind blind und unfähig zu gehen. Mit Bezug auf die Entwicklung des Gehirns, wesentliche kortikalen Reifung erfolgt postnatal. Neugeborene Rattenjungen (Tag der Geburt bezeichneten als postnataler Tag 1; PD1) vorgeschlagen worden eine Hirnreifung Niveau zu erreichen, die zu einer Früh menschlichen Gehirn von 23 ähnlich ist – 28 Wochen Schwangerschaft, während PD7-10 Welpe sind äquivalent zu nahe von- Begriff menschliches Gehirn. 3, 4, 5, 6Diese Korrelation auf grobe anatomische Analysen basiert, jedoch andere Maßnahmen der Gehirnreifung wie Myelinisierung und Amplitude integriert Elektroenzephalogrammen wurden ebenfalls beschrieben. 5, 7 sind beispielsweise prä-Oligodendrozyten die vorherrschenden Zellen in der Entwicklung von humanen fötalen Gehirn 23 bis 32 Wochen im utero und diese Reifungsstufe entspricht ein PD1-3 Nagetier. 5, 8, 9, 10 Außerdem beginnt die Myelinisierung in utero beim Menschen , während in Rattenjungen es in dem Vorderhirn herum PD7-10 erscheint; das neugeborene Gehirn von Nagetieren bleibt weitgehend un-myelinisierte. 11, 12 Tucker et al. festgestellt, dass die Amplitude integriert Elektroenzephalogramm Muster einer Ratte P1 auf eine 23-wöchige gesta ähnlich zu sein,tion menschlichen Fötus, während ein PD7 und PD10 Welpen zu 30 ähnlich ist – 32 Wochen und Begriff Säugling, respectively. 7 Aus diesen Gründen Neugeborenen Reflex – Tests bei neugeborenen Rattenjungen bieten eine Gelegenheit für die Erfassung der Ontogenese und / oder Störung der Gehirnentwicklung.

Die Batterie der Reflexe im Folgenden beschrieben wird von Studien , die von WM Fox und A. Lubics 13, 14 WM Fox war in Bezug auf die Ontogenese der Reflexe bei der Maus eine der frühesten Ermittler angepasst. 13 Diese Reflexe umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, den Körper Greifen und Platzieren, Klippe Vermeidung, aufrichtenden, beschleunigte aufrichtenden, Gang, auditiv startle, Haltung und Augenöffnung. Sowohl forelimb und hindlimb Griff (bezeichnet als palmar plantar und Griff beim Menschen, bzw.) wird durch spinale Reflexe und corticospinal Hemmung von nicht-primären motorischen Arealen erleichtert. 15, 16 Hintergliedmaße Platzierung (Plantarreflex) reflektiert Reifung des corticospinal Traktes. 16, 17, 18 Cliff Vermeidung (Schutzreaktionen), Aufrichten (Labyrinth) und beschleunigte Integration und Kommunikation zwischen sensorischer Input und Motorleistung (wie jene mit dem vibrissae und vestibulären Systemen beteiligt ist ) aufrichtenden beinhaltet. 19, 20, 21 Gait reflektiert Fortbewegung. 14 Auditory startle beurteilt akustische Stimulation und synaptischen Verbindungen von Riesen Neuronen im Nucleus pontis reticularis caudalis. 21 Posture beinhaltet geeignete kortikalen-spinale / Spinal-kortikalen Projektionen, die Muskelkraft, und neuromuskuläre innervation. 22, 23 Maturation der Gamma – Aminobuttersäure – Rezeptoren kann mit Augenöffnung korrelieren. 24 Es ist wichtig , im Auge zu behalten , dass die Reflexe ein viel komplizierteres Netzwerk reflektieren und unter der Voraussetzung hier ist eine allgemeine Korrelation. Darüber hinaus bieten diese Reflexe eine schnelle und einfache Methode der neurologische Entwicklung bei sehr jungen Alter Beurteilung wo komplexere Verhaltenstests nicht durchführbar sind.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine allgemeine Richtlinie für Entwicklung des Nervenreflextest zur Verfügung zu stellen, die leicht in experimentelle neugeborene Ratten Studien aufgenommen werden können. Die beschriebene Methodik wurde in Long-Evans neonatalen Rattenjungen und Quantifizierung der Ergebnisse wurde am ersten Tag des Erscheinens auf Basis durchgeführt. Der Tag, an Test Reflex ausgelöst und das Gerät verwendet wird, kann besser modifiziert werden, um ein anderes experimentelles Modell zu passen (zB für verschiedene Stämme und Arten). Durch den normalen physiologischen Verlauf der ref Gründunglex Reifung in einer spezifischen Tiermodell können Forscher die Auswirkungen externer Stressoren, endogene Manipulationen und / oder therapeutische Eingriffe auf die neurologische Entwicklung in neonatalen Rattenmodellen bewerten. Insgesamt ist die Verwendung von Reflexen als Bestimmung der Hirnreife vorteilhaft in perinatalen Hirnschädigung vorherzusagen, und ist repräsentativ für später der Entwicklung des Nerven Ergebnisse.

Protocol

Die Animal Care und Use Committee, Gesundheitswissenschaften an der University of Alberta genehmigt alle Tierstudien. Hinweis: Während dieses Protokoll auf andere Arten und Stämme kann angepasst werden, dieses Protokoll für Long-Evans-Ratten geschrieben. Diese Ratten wurden überlegene Motorleistungen und Sehschärfe haben im Vergleich zu anderen Nagetier-Stämmen gezeigt. 25, 26 Das Protokoll für timed Schwangerscha…

Representative Results

Die Zeitleiste des experimentellen Designs ist in Abbildung 2 dargestellt. 30 Die Methoden und Ergebnisse wurden bereits veröffentlicht. 30 Das Ziel der Studie war es zu beurteilen , ob eine Nahrungsergänzung mit Brokkolisprossen während der Schwangerschaft und der preweaning Zeit die Nachkommen von der Entwicklung des Nerven Verzögerung geschützt , induziert durch in utero Exposition…

Discussion

Die Entwicklung des Nervenreflextest ist eine prädiktive Maß für abnorme kortikale Entwicklung und Reifung, die von Bedeutung unter Umständen sein kann, wo offenkundige Neuropathologie nicht offensichtlich ist. Während der Entwicklung des Nerven Tests ist es entscheidend, um sicherzustellen, dass Welpen täglich zur gleichen Zeit untersucht werden. Ratten sind nachtaktiv und daher ihr zirkadianer Rhythmus kann die Leistung ändern, wenn Tests zu verschiedenen Zeiten während des Tages durchgeführt wird. <sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten unsere Förderagenturen danken, die NeuroDevNet (eine nationale Kompetenzzentren), die ALVA-Stiftung, die Frauen und Kinder Health Research Institute und der University of Alberta umfassen.

Materials

Breeding
Transfer pipettes Fisherbrand 12-711-9AM Used for vaginal flushes.
Sterile Saline Hospira 7983254 The solution used to collect cells during vaginal flushes.
400 µl Microcentrifuge tubes Fisherbrand 05-408-120 Used to hold the saline solution.
Light microscope Leica Leica ATC 2000 For observation of the saline solution. Can be any light microscope used in the lab.
Slides Fisherbrand 12-552-5 The saline solution is placed on the slide. Can be any slides used in the lab.
Coverslips Fisherbrand 12-545-F To coverslip the slides. Can use any coverslips used in the lab.
Dietary  Supplementation
Broccoli Sprouts seeds Mumm's Sprouting Seeds Broccoli sprouts seeds are ordered and grown in the lab.
Countertop Seed Sprouter Box Mumm's Sprouting Seeds A box is used to germinate and grow the seeds prior to harvest.
250 mL beaker The beaker is used to soak the seed. Any size beaker that would fit can be used.
Maternal Inflammation
Lipoplysaccharide (LPS) Sigma L3129 The endotoxin used to mimic maternal inflammation.
1 mL Syringe BD Syringe 309659 Used to inject the pregnant rat.
Gauge (30G X 1/2) BD PrecisionGlide Needle 305106 Use the smallest needle to avoid pain and discomfort.
Sterile Saline (0.9% Sodium Chloride, USP) Hospira Saline is used to dissolve LPS.
Weights
Scale Denver Instrument For recording the weights. Can be any scale with 2 decimal places used in the lab.
Neurodevelopmental Reflexes
Thin blunt rod Can be a paperclip or toothpick. This is for forelimb and hindlimb grasping.
Round filter paper Whatman 1001 150 15 cm diameter paper used for gait analysis.
Timer Fisher Scientific 06-662-51 For timing the time allocated to righting and gait.
Blunt surface Can be an edge of a table. This is for hindlimb placing and cliff avoidance.
Foam landing For when the pups perform accelerated righting.
Video recorder Sony VCT-D580RM To record all reflexes tested. Must be able to record at 1/1000 fps
Bell For auditory startle. 
Heat lamp or pad To maintain the body temperature of the pups underoing examination.

References

  1. Farber, J. M., Shapiro, B. K., Palmer, F. B., Capute, A. J. The diagnostic value of the neurodevelopmental examination. Clin Pediatr (Phila. 24 (7), 367-372 (1985).
  2. Zafeiriou, D. I. Primitive reflexes and postural reactions in the neurodevelopmental examination). Pediatr. Neurol. 31 (1), 1-8 (2004).
  3. Clancy, B., Finlay, B. L., Darlington, R. B., Anand, K. J. S. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28 (5), 931-937 (2007).
  4. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Hum. Dev. 3 (1), 79-83 (1979).
  5. Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog. Neurobiol. , (2013).
  6. Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Arch. Dis. Child. 48 (10), 757-767 (1973).
  7. Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr. Res. 65 (1), 62-66 (2009).
  8. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with. Dev. Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  9. Back, S. A., Riddle, A., McClure, M. M. Maturation-dependent vulnerability of perinatal white matter in premature birth. Stroke. 38, 724-730 (2007).
  10. Back, S. A., et al. Late oligodendrocyte progenitors coincide with the developmental window of vulnerability for human perinatal white matter injury. J. Neurosci. 21 (4), 1302-1312 (2001).
  11. Downes, N., Mullins, P. The development of myelin in the brain of the juvenile rat. Toxicol. Pathol. 42 (5), 913-922 (2014).
  12. Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front. Neuroanat. 3 (5), (2009).
  13. Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim. Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
  14. Lubics, A., et al. Neurological reflexes and early motor behavior in rats subjected to neonatal hypoxic-ischemic injury. Behav. Brain Res. 157 (1), 157-165 (2005).
  15. Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int. J. Pediatr. , 191562 (2012).
  16. Hashimoto, R., Tanaka, Y. Contribution of the supplementary motor area and anterior cingulate gyrus to pathological grasping phenomena. Eur. Neurol. 40 (3), 151-158 (1998).
  17. Isaza Jaramillo, S. P., et al. Accuracy of the Babinski sign in the identification of pyramidal tract dysfunction. J. Neurol. Sci. 343 (1-2), 66-68 (2014).
  18. Donatelle, J. M. Growth of the corticospinal tract and the development of placing reactions in the postnatal rat. J. Comp. Neurol. 175 (2), 207-231 (1977).
  19. Palanza, P., Parmigiani, S., vom Saal, F. S. Effects of Prenatal Exposure to Low Doses of Diethylstilbestrol, o,p’DDT and Methoxychlor on Postnatal Growth and Neurobehavioral Development in Male and Female Mice. Horm. Behav. 40 (2), 252-265 (2001).
  20. Pantaleoni, G. C., et al. Effects of maternal exposure to polychlorobiphenyls (PCBs) on F1 generation behavior in the rat. Fundam. Appl. Toxicol. 11 (3), 440-449 (1988).
  21. Yeomans, J. S., Frankland, P. W. The acoustic startle reflex: neurons and connections. Brain Res. Rev. 21 (3), 301-314 (1995).
  22. Vinay, L., Brocard, F., Clarac, F. Differential maturation of motoneurons innervating ankle flexor and extensor muscles in the neonatal rat. Eur. J. Neurosci. 12 (12), 4562-4566 (2000).
  23. Geisler, H. C., Westerga, J., Gramsbergen, A. Development of posture in the rat. Acta Neurobiol. Exp.(Wars. 53 (4), 517-523 (1993).
  24. Heinen, K., et al. Gabaa receptor maturation in relation to eye opening in the rat visual cortex). Neuroscience. 124 (1), 161-171 (2004).
  25. Whishaw, I. Q., Gorny, B., Foroud, A., Kleim, J. A. Long-Evans and Sprague-Dawley rats have similar skilled reaching success and limb representations in motor cortex but different movements: some cautionary insights into the selection of rat strains for neurobiological motor research. Behav. Brain Res. 145 (1-2), 221-232 (2003).
  26. Prusky, G. T., Harker, K. T., Douglas, R. M., Whishaw, I. Q. Variation in visual acuity within pigmented, and between pigmented and albino rat strains. Behav. Brain Res. 136 (2), 339-348 (2002).
  27. Wu, L., et al. Dietary approach to attenuate oxidative stress, hypertension, and inflammation in the cardiovascular system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (18), 7094-7099 (2004).
  28. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and. J. Vis. Exp. (67), (2012).
  29. Rousset, C. I., et al. Maternal exposure to lipopolysaccharide leads to transient motor dysfunction in neonatal rats. Dev. Neurosci. 35 (2-3), 172-181 (2013).
  30. Nguyen, A. T., Bahry, A. M. A., Shen, K. Q., Armstrong, E. A., Yager, J. Y. Consumption of broccoli sprouts during late gestation and lactation confers protection against developmental delay induced by maternal inflammation. Behav. Brain Res. 307, 239-249 (2016).
  31. Black, A. M., Armstrong, E. A., Scott, O., Juurlink, B. J., Yager, J. Y. Broccoli sprout supplementation during pregnancy prevents brain injury in the newborn rat following placental insufficiency. Behav. Brain Res. 291, 289-298 (2015).
  32. Wainwright, P. E. Issues of design and analysis relating to the use of multiparous species in developmental nutritional studies. J. Nutr. 128 (3), 661-663 (1998).
  33. Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neurosci. 14, 14-37 (2013).
  34. Sergio, D. P., Sanchez, S., Ruben, V. R., Ana, B. R., Barriga, C. Changes in behaviour and in the circadian rhythms of melatonin and corticosterone in rats subjected to a forced-swimming test. J Appl Biomed. 1 (47), (2005).
  35. Castelhano-Carlos, M., Baumans, V. The impact of light, noise, cage cleaning and in-house transport on welfare and stress of laboratory rats. Lab. Anim. 43 (4), 311-327 (2009).
  36. Zimmerberg, B., Ballard, G. A., Riley, E. P. The development of thermoregulation after prenatal exposure to alcohol in rats. Psychopharmacology (Berl. 91 (4), 479-484 (1987).
  37. Fan, L. W., et al. Hypoxia-ischemia induced neurological dysfunction and brain injury in the neonatal rat). Behav. Brain Res. 165 (1), 80-90 (2005).
  38. Smart, J. L., Dobbing, J. Vulnerability of developing brain. VI. Relative effects of foetal and early postnatal undernutrition on reflex ontogeny and development of behaviour in the rat. Brain Res. 33 (2), 303-314 (1971).
  39. Fox, M. W. Neuro-Behavioral ontogeny: A synthesis of ethological and neurophysiological concepts. Brain Res. 2 (1), 3-20 (1966).
  40. Piper, M. C., Mazer, B., Silver, K. M., Ramsay, M. Resolution of neurological symptoms in high-risk infants during the first two years of life. Dev. Med. Child Neurol. 30 (1), 26-35 (1988).
  41. Shiotsuki, H., et al. A rotarod test for evaluation of motor skill learning. J. Neurosci. Methods. 189 (2), 180-185 (2010).
  42. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat. Protoc. 1 (2), 848-858 (2006).
  43. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat. Protoc. 2 (2), 322-328 (2007).

Play Video

Cite This Article
Nguyen, A. T., Armstrong, E. A., Yager, J. Y. Neurodevelopmental Reflex Testing in Neonatal Rat Pups. J. Vis. Exp. (122), e55261, doi:10.3791/55261 (2017).

View Video