मानव pluripotent की इन विट्रो भेदभाव में स्टेम कोशिकाओं Trophoblastic में कोशिकाओं
Summary
Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.
Abstract
नाल embryogenesis दौरान विकसित करने के लिए पहली अंग है और विकासशील भ्रूण के अस्तित्व के लिए आवश्यक है। नाल विभिन्न trophoblastic कोशिकाओं है कि preimplantation ब्लास्टोसिस्ट के अतिरिक्त भ्रूण ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाओं से अलग के शामिल है। जैसे, मानव प्लेसेंटा के प्रारंभिक भेदभाव की घटनाओं के बारे में हमारी समझ क्योंकि अलगाव और मानव embryogenesis के हेरफेर पर नैतिक और कानूनी प्रतिबंध के सीमित है। मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) मानव विकास की जांच के लिए एक मजबूत मॉडल व्यवस्था कर रहे हैं और यह भी trophoblastic कोशिकाओं है कि विभिन्न trophoblast प्रकार की कोशिकाओं के मार्कर एक्सप्रेस में इन विट्रो में भेदभाव किया जा सकता है। यहाँ, हम हड्डी morphogenic प्रोटीन 4 और Activin / नोडल संकेत दे रास्ते के अवरोधकों का उपयोग कर trophoblastic कोशिकाओं में hPSCs फर्क के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं trophoblast कि siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता उत्पन्न करता हैनुकसान के समारोह phenotypes की जांच या रोगजनकों से संक्रमित हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, hPSCs आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है और उसके बाद के लिए के समारोह के लाभ का विश्लेषण करती है trophoblast progenitors में विभेदित। HPSCs से शुरू मानव trophoblasts पैदा करने के लिए इन विट्रो भेदभाव विधि जल्दी मानव भ्रूण के साथ काम करने का नैतिक और कानूनी प्रतिबंध पर काबू पा, और इस प्रणाली के आवेदनों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, दवाओं की खोज और स्टेम सेल अनुसंधान भी शामिल है।
Introduction
नाल गर्भावस्था के दौरान विकास और भ्रूण के अस्तित्व के लिए आवश्यक और मातृ और भ्रूण संचलन के बीच गैसों, पोषक तत्वों, अपशिष्ट उत्पादों, और हार्मोन के आदान-प्रदान की सुविधा है। पहली अंग स्तनधारी embryogenesis दौरान गठन नाल, जो 6-7 दिनों के विकास शुरू होता है चूहों 1, 2, 3, 4 में 3.5-4.5 दिनों मानव में पोस्ट-गर्भाधान और है। Trophoblastic कोशिकाओं नाल का सबसे महत्वपूर्ण कोशिकाओं रहे हैं, और इन कोशिकाओं स्तनधारी भ्रूण की जल्द से जल्द वंश भेदभाव की घटनाओं में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं। वे preimplantation ब्लास्टोसिस्ट के बाहरी अतिरिक्त भ्रूण ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाओं से उत्पन्न होती हैं। अपरा विकास के प्रारंभिक दौर के हमारे ज्ञान जल्दी मानव विकास मॉडलिंग पर नैतिक और सैन्य प्रतिबंधों द्वारा सीमित है।
भ्रूण आरोपण, trophoblasts के दौरानमातृ उपकला आक्रमण और विशेष पूर्वज कोशिकाओं 5 में अंतर है। Cytotrophoblasts (CTBs) mononucleated कर रहे हैं, undifferentiated progenitors कि फ्यूज और syncytiotrophoblasts (SYNs) और extravillous आक्रामक trophoblasts (EVTs) में अंतर है, जो लंगर गर्भाशय को अपरा। SYNs multinucleated कर रहे हैं, टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं है कि गर्भावस्था को बनाए रखने के लिए आवश्यक हार्मोन synthesize। जल्दी भेदभाव की घटनाओं है कि EVTs और SYNs उत्पन्न, अपरा गठन के लिए आवश्यक हैं के रूप में trophoblastic कोशिकाओं में क्षति गर्भपात, पूर्व एक्लंप्षण, और जन्म के समय वजन 1 में परिणाम। मानव ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइनों के प्रकार है कि विकसित किया गया है और CTBs choriocarcinomas, जो अपरा हार्मोन और प्रदर्शन आक्रामक गुण 6 का उत्पादन अमर शामिल हैं। मानव पहली तिमाही गर्भनालों से प्राथमिक trophoblastic कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है, लेकिन कोशिकाओं को जल्दी से अलगferentiate और इन विट्रो में proliferating बंद करो। महत्वपूर्ण बात है, बदल गया है और प्राथमिक सेल लाइनों अलग जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल है, यह दर्शाता है कि tumorigenic और अमर trophoblast सेल लाइनों सही प्राथमिक trophoblasts 7 प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता। इसके अतिरिक्त, इन लाइनों अपरा trophoblast स्टेम सेल progenitors जैसे लगते हैं, क्योंकि वे पहले तीसरे trimesters के माध्यम से बाद में मंच से प्राप्त कर रहे हैं संभावना नहीं है।
अपरा के गठन और समारोह के प्रारंभिक घटनाओं का अध्ययन करने के क्रम में प्रारंभिक अवस्था मानव trophoblasts के इन विट्रो संस्कृति प्रणाली में एक मजबूत करने की जरूरत है। मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) है, जो साझा preimplantation भ्रूण के आंतरिक कोशिका द्रव्यमान के साथ गुण, अक्सर जल्दी मानव विकास के मॉडल के लिए, जल्दी नाल के गठन सहित उपयोग किया जाता है। दोनों मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) और hESCs अस्थि मोर का उपयोग कर इन विट्रो में trophoblasts में भेदभाव किया जा सकताphogenic प्रोटीन 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15। BMP4 का उपयोग कर trophoblastic कोशिकाओं को pluripotent कोशिकाओं का यह रूपांतरण मानव कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है और व्यापक रूप से है क्योंकि यह जल्दी मानव भ्रूण 9, 16 के लिए उपयोग की आवश्यकता नहीं है जल्दी मानव प्लेसेंटा के विकास का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हाल ही में, यह पाया गया कि अवरोधकों के अलावा A83-01 (ए) और PD173074 (पी), जो SMAD2 / 3 और MEK1 / 2 संकेत दे रास्ते को ब्लॉक, ट्रोफेक्टोडर्म-तरह पूर्वज, मुख्य रूप से SYNs में hPSC भेदभाव की क्षमता बढ़ जाती है और EVTs, mesoderm, endoderm, या बाह्य त्वक स्तर कोशिकाओं 9, 17 के व्यापक पीढ़ी के बिना </sup>। इन मध्यम शर्तों का उपयोग करना, hESCs भेदभाव कर 12 दिनों मानव ब्लास्टोसिस्ट चरण भ्रूण से अलग ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाओं के रूप में इसी तरह के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल है और विभिन्न अपरा-विशिष्ट वृद्धि हार्मोन स्रावित के लिए, यह इन विट्रो मॉडल प्रणाली 9, 11 की वैधता का समर्थन। यहाँ, हम BMP4 / ए / पी संस्कृति के माध्यम का उपयोग मानव trophoblast progenitors में hPSCs की इन विट्रो भेदभाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इन हालात में शाही सेना अनुक्रमण, जीन व्यवधान siRNAs का उपयोग कर, रोगज़नक़ संक्रमण, और आनुवंशिक संशोधन lipofection की मध्यस्थता अभिकर्मक का उपयोग कर सहित आवेदन की एक विस्तृत विविधता के लिए कोशिकाओं की प्रचुर संख्या का उत्पादन।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम trophoblast progenitors में hESCs फर्क के लिए बुनियादी कदम प्रस्तुत किया। इस प्रोटोकॉल हाल ही में trophoblastic कोशिकाओं को भेदभाव बढ़ रही है और mesoderm पूर्वज है, जो आम तौर पर अकेले BMP4 उपचार के साथ मनाया जाता है की पीढ़ी से बचने के ल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 um syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
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