ייצור של מכשירי microfluidic נייר מבוססים תלת ממדי עבור Immunoassays
Summary
אנו בפירוט שיטה לפברק מכשירים microfluidic תלת מימדי המבוסס על נייר לשימוש בפיתוח immunoassays. הגישה שלנו הרכבת מכשיר היא סוג של multilayer, ייצור כתוסף. אנחנו מדגימים immunoassay כריך לספק תוצאות נציג עבור סוגים אלה של מכשירים מבוססי נייר.
Abstract
נייר פתילות נוזלים באופן עצמאי בשל פעולת נימים. על ידי דפוסי נייר עם חסמי הידרופובי, להובלת נוזלים ניתן לשלוט וביימה בתוך שכבה של נייר. יתר על כן, לערום מספר שכבות של נייר בדוגמת יוצר רשתות microfluidic תלת ממדי מתוחכם שיכול לתמוך בפיתוח של מבחני אנליטיים bioanalytical. נייר מבוסס התקני microfluidic זולים, ניידים, קלים לשימוש, ואין צורך בציוד חיצוני לפעול. כתוצאה מכך, הם מחזיקים הבטחה גדולה כפלטפורמה לאבחון נקודות של טיפול. על מנת להעריך את השירות כראוי ביצועים אנליטיים של מכשירים מבוססי נייר, שיטות מתאימות חייבות להיות מפותחות על מנת להבטיח הייצור שלהם הוא לשחזור בקנה מידה שמתאים הגדרות במעבדה. בכתב היד הזה, שיטה לפברק ארכיטקטורה לשימוש כללי בבניית מכשירים שיכולים לשמש immunoassays מבוססי נייר מתואר. אנו משתמשים בצורה כלשהי של manufacturin כתוסףg (למינציה רבה שכבתית) להכין תקני מרכיבות מספר שכבות של נייר בדוגמת דבקה בדוגמת. בנוסף הוכחת את השימוש הנכון של תלת ממדי אלה מכשירים microfluidic מבוססי נייר עם immunoassay עבור גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG), שגיאות בתהליך הייצור שעשויים לגרום לכשלים מכשיר הם דנו. אנו מצפים גישה זו לייצור מכשירים מבוסס נייר ימצא כלי רחב בפיתוח יישומים אנליטיים שתוכננו במיוחד עבור הגדרות מוגבלות במשאבים.
Introduction
נייר זמין נרחב במגוון של ניסוחים או ציונים, יכולה להיות פונקציונלי לכוון את המאפיינים שלו, יכול להעביר נוזלים באופן אוטונומי על ידי פעולת נימים או פתילה. אם הנייר הוא בדוגמת עם חומר הידרופובי (למשל, photoresist 1 או 2 שעווה), את הפתילה של נוזלים ניתן לשלוט מרחבית בתוך שכבה של נייר. לדוגמא, מדגם מימי שימושי יכול להיות מופנה למספר האזורים השונים כדי להגיב עם ריאגנטים כימיים וביוכימיים מאוחסנים בתוך הנייר. מכשירי microfluidic מבוסס נייר אלה הוכחו להיות פלטפורמה שימושית לפיתוח של מבחני אנליטית ניידים וזולים 3, 4, 5, 6, 7. יישומים של מכשירים microfluidic מבוססי נייר כוללים אבחון הצבע של טיפולEF "> 8, ניטור של מזהמים סביבתיים 9, זיהוי של תרופות מזויפות 10, ובריאות delocalized (או" טלרפואה ") ב-משאב מוגבל הגדרות 11.
מספר שכבות של נייר בדוגמת ניתן לקבץ אותם לתוך מכשיר משולב היכן אזורי הידרופילי משכבות שכנות (כלומר, מעל או מתחת) להתחבר מקימים רשתות fluidic רציפות אשר מפרצוני שקעים עשויים להיות יחד או שמאלה עצמאיות. שכבה 12 כל אחד יכול מהווים דפוס ייחודי, אשר מאפשר הפרדה מרחבית של ריאגנטים מבחני מרובים להתבצע על מכשיר אחד. המכשיר microfluidic תלת ממדי המתקבל הוא לא רק מסוגל הפתילה נוזלים כדי לאפשר מבחני אנליטית (למשל, תפקודי כבד בדיקות 13 ו זיהוי אלקטרוכימי של מולקולות קטנות 14), אבל זה יכול גם supיציאת מספר הפונקציות מתוחכמות (למשל, שסתומי 15 ופשוט מכונה 16) המשותף לגישות microfluidic מסורתיות. חשוב לציין, כי נייר פתילות נוזלים על ידי פעולה נימי, מכשירים אלה יכולים להיות מופעלים עם מאמץ מינימאלי מהמשתמש.
מאז ריאגנטים ניתן לאחסן בתוך הארכיטקטורה תלת ממדי של מכשיר המבוסס על נייר, פרוטוקולים מורכבים ניתן לצמצם תוספת אחת של מדגם מימית למכשיר. לאחרונה, הצגנו ארכיטקטורה מכשיר תלת ממדי כללי שניתן להשתמש בהם לפיתוח immunoassays מבוססי נייר בטכניקה שעווה ההדפסה כדי ליצור שכבות בדוגמת. 17, 18 מחקרים אלה התמקדו כיצד היבטים הקשורים בעיצוב של המספר-ההתקן של שכבות מוערמות בשימוש, בהרכב השכבות, ואת התבנית של שבשליטת הרשת microfluidic תלת ממדי לכל הכלליותformance של immunoassay. בסופו של דבר, הצלחנו להשתמש בכללים הללו עיצוב להקל על ההתפתחות המהירה של immunoassay מרובב 19. בכתב היד הזה, immunoassay שפותחו בעבר עבור גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG; הורמון ההריון) 17 משמש כדוגמה כדי להמחיש את האסטרטגיות שפיתחנו עבור הרכבה וייצור של immunoassays תלת מימדי המבוסס על נייר. בהתאם לכך, אנו מתמקדים ההרכבה וההפעלה של מכשיר ולא לפיתוח assay.
בעוד immunoassay כריך, אשר הוא התבנית המשמשת לאיתור hCG, לכידת נוגדן ספציפי למקטע אחד של ההורמון מצופה על מצע מוצק, אשר נחסם אז להגביל את הספיחה הלא הספציפית של מדגם או כל מגיב שלאחר מכן. המצע הזה הוא לרוב צלחת microwell קלקר (למשל, עבור assay immunosorbent enzyme-linked או ELISA). המדגם הוא אזהתווסף באר מותר דגירה במשך פרק זמן מסוים. לאחר כביסה קפדנית, נוגדן ספציפי לתת יחידה האחרת של hCG מתווסף ואפשר כדי לדגור. נוגדן זה גילוי ניתן מצומדות כדי חלקיק קולואידים, אנזים, או fluorophore כדי לייצר אות למדידה. הבאר נשטפה שוב לפני לפרש את התוצאות של assay (למשל, באמצעות קורא צלחת). בעוד ערכות מסחריות להסתמך על תהליך רב שלבים רבים הפעם, כל השלבים הללו יכולים להתבצע במהירות מכשירי microfluidic מבוסס נייר עם התערבות מינימאלית למשתמש.
המכשיר משמש immunoassay hCG מונה שש שכבות פעילות, אשר הן, מלמעלה למטה, המשמשות בנוסף מדגם, אחסון המצומד, דגירה, ללכוד, לשטוף, כתם (איור 1). ההשכבה בנוסף מדגם עשויה נייר סינון איכותי. זה הופך לפשוט יותר כניסתה של מדגם נוזלי ומגן על ריאגנטים המצומד Layer מזיהום מהסביבה או מגע מקרי על ידי המשתמש. השכבה המצומד (נייר סינון איכותי) מחזיקה מגיב בייצור צבעים (למשל, נוגדן זהב שכותרתו קולואידים) עבור immunoassay. שכבת הדגירה (נייר סינון איכותי) מאפשרת המדגם לנסוע חילופי תפקידים בתוך המטוס של העיתון כדי לקדם מחייב של אנליטי עם ריאגנטים לפני ההגעה לשכבה הבאה, השכבה ללכוד. השכבה ללכוד (קרום ניילון) מכילה ליגנדים ספציפיים עבור אנליטי שנספח החומר. לאחר assay הושלמה, שכבה זו מתגלה כדי לאפשר הדמיה של immunocomplex הושלמה. השכבה לשטוף (נייר סינון איכותי) שואבת עודף נוזלים כולל ריאגנטים חינם המצומד הרחק פני שכבת ללכוד לתוך שכבת כתם (נייר כרומטוגרפיה עבה). המכשיר שש השכבתי מוחזק ביחד על ידי חמש שכבות של דבק בדוגמת, דו צדדי: ארבע שכבות של דבק קבוע לשמור על השלמות של עאסםמכשיר דימם שכבה אחת של דבק נשלף המקלה קילוף של המכשיר כדי לבדוק את התוצאות של immunoassay על השכבה ללכוד.
לצורך כתב יד זה, אנו משתמשים רק דגימות בקרה שליליות וחיוביות של hCG (0 mIU / mL ו -81 mIU / mL, בהתאמה) על מנת לספק תוצאות נציג של immunoassay מבוסס נייר, המאפשר דיון ייעודי של מערכת היחסים בין שיטות ייצור ואת הביצועים של המכשיר. בנוסף הוכחה כיצד לייצר מכשירים בהצלחה, אנו מדגישים כמה שגיאות ייצור שיכול להוביל לכישלון של התקן או תוצאות assay irreproducible. הפרוטוקול והדיון מפורט בכתב היד הזה יספקו לחוקרים עם תובנה חשובה איך immunoassays מבוסס נייר מתוכנן מפוברק. בעוד אנו מתמקדים ההפגנה שלנו על immunoassays, אנו צופים כי הקווים המנחים המוצגים במסמך זה יהיה שימושי רחב לייצור שלושה דימןsional נייר מבוסס מכשירי microfluidic.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהוי אסטרטגית ייצור לשחזור היא מרכיב חיוני של פיתוח assay. 22 אנו משתמשים בגישה סדרתית, שכבה אחר שכבה לייצר מכשירים microfluidic מבוססי נייר תלת ממדי. בניגוד לשיטות אלה החלים טכניקות קיפול או אוריגמי לייצר מכשירים multilayer מתוך גיליון נייר אחד 23, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Tufts University and by a generous gift from Dr. James Kanagy. This material is based upon work supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. (DGE-1325256) that was awarded to S.C.F. D.J.W. was supported by a U.S. Department of Education GAANN fellowship. We thank Dr. Jeremy Schonhorn (JanaCare), Dr. Jason Rolland (Carbon3D), and Rachel Deraney (Brown University) for helping develop the design of the three-dimensional paper-based microfluidic device and immunoassay.
Materials
| Illustrator CC | Adobe | to design patterns for layers of paper and adhesive | |
| Xerox ColorQube 8580 printer | Amazon | B00R92C9DI | to print wax patterns onto layers of paper and Nylon |
| Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven | Fisher Scientific | 15-103-0509 | to melt wax into paper |
| Artograph LightTracer | Amazon | B000KNHRH6 | to assist with alignment of layers |
| Apache AL13P laminator | Amazon | B00AXHSZU2 | to laminate layers together |
| Graphtec CE6000 Cutting Plotter | Graphtec America | CE6000-40 | to pattern adhesive films |
| Swingline paper cutter | Amazon | B0006VNY4C | to cut paper or devices |
| Epson Perfection V500 photo scanner | Amazon | B000VG4AY0 | to scan images of readout layer |
| economy plier-action hole punch | McMaster-Carr | 3488A9 | to remove alignment holes |
| Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4 | Sigma Aldrich | WHA1004917 | |
| Fisherbrand chromatography paper (thick) | Fisher Scientific | 05-714-4 | to function as blot layer |
| Immunodyne ABC (0.45 µm pore size ) | Pall Corporation | NBCHI3R | to function as material for capture layer |
| removable/permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF021621 | to facilitate peeling |
| permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF051521 | |
| wax liner | FLEXcon | FLEXMARK 80 D/F PFW LINER | to assist with patterning adhesive |
| acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | to fabricate frame |
| self-adhesive sheets | Fellowes | CRC52215 | to use as protective slip |
| absolute ethanol | VWR | 89125-172 | to sanitize work area |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 0332 | |
| Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls | Fisher Scientific | 22-071-066 | to use as positive and negative samples |
| anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1) | Arista Biologicals | CGBCG-0701 | to treat conjugate layer |
| goat anti-α-hCG antibody | Arista Biologicals | ABACG-0500 | to treat capture layer |
| 10X phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Oxoid skim milk powder | Thermo Scientific | OXLP0031B | |
| Tween 20 | AMRESCO | M147 |
References
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 8 (12), 2146-2150 (2008).
- Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 81 (16), 7091-7095 (2009).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. 46 (8), 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Diagnostics for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Chem. 82 (1), 2-10 (2010).
- Cate, D. M., Adkins, J. A., Mettakoonpitak, J., Henry, C. S. Recent developments in paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 87 (1), 19-41 (2015).
- Li, X., Ballerini, D. R., Shen, W. A perspective on paper-based microfluidics: Current status and future trends. Biomicrofluidics. 6, 011301 (2012).
- Lisowski, P., Zarzycki, P. K. Microfluidic paper-based analytical devices (µPADs) and micro total analysis systems (µTAS): Development, applications and future trends. Chromatographia. 76, 1201-1214 (2013).
- Pollock, N. R., et al. A paper-based multiplexed transaminase test for low-cost, point-of-care liver function testing. Sci. Transl. Med. 4 (152), 152ra129 (2012).
- Mentele, M. M., Cunningham, J., Koehler, K., Volckens, J., Henry, C. S. Microfluidic paper-based analytical device for particulate metals. Anal. Chem. 84 (10), 4474-4480 (2012).
- Weaver, A. A., et al. Paper analytical devices for fast field screening of beta lactam antibiotics and antituberculosis pharmaceuticals. Anal. Chem. 85 (13), 6453-6460 (2013).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Vella, S. J., et al. Measuring markers of liver function using a micro-patterned paper device designed for blood from a fingerprick. Anal Chem. 84 (6), 2883-2891 (2012).
- Nie, Z., Deiss, F., Liu, X., Akbulut, O., Whitesides, G. M. Integration of paper-based microfluidic devices with commercial electrochemical readers. Lab Chip. 10 (22), 3163-3169 (2010).
- Martinez, A. W., et al. Programmable diagnostic devices made from paper and tape. Lab Chip. 10 (19), 2499-2504 (2010).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper machine" for molecular diagnostics. Anal. Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Schonhorn, J. E., Fernandes, S. C., Rajaratnam, A., Deraney, R. N., Rolland, J. P., Mace, C. R. A device architecture for three-dimensional, patterned paper immunoassays. Lab Chip. 14 (24), 4653-4658 (2014).
- Fernandes, S. C., Logounov, G. S., Munro, J. B., Mace, C. R. Comparison of three indirect immunoassay formats on a common paper-based microfluidic device architecture. Anal. Methods. 8 (26), 5204-5211 (2016).
- Deraney, R. N., Mace, C. R., Rolland, J. P., Multiplexed Schonhorn, J. E. patterned-paper immunoassay for detection of malaria and dengue fever. Anal. Chem. 88 (12), 6161-6165 (2016).
- Abramoff, M., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Derda, R., et al. Multizone paper platform for 3D cell cultures. PLoS ONE. 6 (5), e18940 (2011).
- Mace, C. R., Deraney, R. N. Manufacturing prototypes for paper-based diagnostic devices. Microfluid. Nanofluidics. 16 (5), 801-809 (2014).
- Liu, H., Crooks, R. M. Three-dimensional paper microfluidic devices assembled using the principles of origami. J. Am. Chem. Soc. 133 (44), 17564-17566 (2011).
- Kalish, B., Tsutsui, H. Using Adhesive patterning to construct 3D paper microfluidic devices. J. Vis. Exp. (110), e53805 (2016).
- Scida, K., Cunningham, J. C., Renault, C., Richards, I., Crooks, R. M. Simple, sensitive, and quantitative electrochemical detection method for paper analytical devices. Anal. Chem. 86 (13), 6501-6507 (2014).
- Lewis, G. G., DiTucci, M. J., Baker, M. S., Phillips, S. T. High throughput method for prototyping three-dimensional, paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 12 (15), 2630-2633 (2012).
- Kalish, B., Tsutsui, H. Patterned adhesive enables construction of nonplanar three-dimensional paper microfluidic circuits. Lab Chip. 14 (22), 4354-4361 (2014).
- Camplisson, C. K., Schilling, K. M., Pedrotti, W. L., Stone, H. A., Martinez, A. W. Two-ply channels for faster wicking in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 15 (23), 4461-4466 (2015).
