Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Måle og endre Mating Drive i Male Published: February 15, 2017 doi: 10.3791/55291
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 3
1F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, 2Harvard NeuroDiscovery Center, Harvard Medical School, 3Department of Neurobiology, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikkelen beskriver en atferdsanalyse som bruker mannlige parring stasjonen i Drosophila melanogaste r å studere motivasjon. Ved hjelp av denne metoden, kan forskerne utnytte avansert flue neurogenetic teknikker for å avdekke genetiske, molekylære og cellulære mekanismer som ligger til grunn for denne motivasjonen.

Abstract

Til tross for flere tiår med etterforskning, de nevronale og molekylære grunnlaget for motiverende stater forblir mystisk. Vi har nylig utviklet en ny, reduksjonistisk, og skalerbart system for grundig undersøkelse av motivasjonen med parring stasjonen på mannlig bananflue (Drosophila), metodene som vi detalj her. Den atferds paradigmet sentre på funn at mannlige parring kjøretur synker sammen fruktbarhet i løpet av gjentatte copulations og gjen løpet ~ 3 d. I dette systemet, de kraftige neurogenetic verktøy tilgjengelig i flue konvergere med den genetiske tilgjengelighet og antatte koblingsskjema tilgjengelig for seksuell atferd. Dette konvergens tillater rask isolasjon og avhør av små nevronale populasjoner med spesifikke motiverende funksjoner. Her har vi detalj utforming og gjennomføring av metthet analyse som brukes til å måle og endre frieri motivasjon i den mannlige fly. Ved hjelp av denneanalysen, viser vi også at lav mannlige parring stasjonen kan overvinnes ved å stimulere dopaminerge nevroner. Satiety analysen er enkel, rimelig og robust til påvirkninger av genetisk bakgrunn. Vi forventer at satiety analyse for å generere mange nye innsikt i nevrobiologi motiverende stater.

Introduction

Arbeid i Drosophila har gitt dype og banebrytende innsikt i mange biologiske fenomener, herunder arten av genet 1, prinsipper for embryoutvikling 2, døgnrytme 3, og utvikling og kabling av nervesystemet 4, 5, 6. Motivasjon er fortsatt langt mindre forstått enn disse fenomenene, kanskje på grunn av begrensninger på de systemene som har blitt studert så langt. Motivasjon i fly er primært studert i sammenheng med sult, som presenterer mange utfordringer på grunn av deres forsvinnende liten matinntak per fôring bout og exoskeleton som utelukker klare tegn på fett deponering. Følgelig er det et behov for å utvide de systemer som benyttes for å studere motivasjon i fly.

Vi beskriver en atferds rammeverk for studiet av parring stasjonen iDrosophila. Dette systemet utnytter de neurogenetic verktøyene i fly så vel som tilgjengeligheten 7, 8, 9, 10, 11, 12 og den antatte connectome av dens seksuelt dimorf kretsen 8, 13. I tillegg er mye av det medfødte 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 og lært 22, 23, 24 sensoriske-motor kretser kontrollerende frieri er utarbeidet i detalj, og gir en sjelden mulighetå finne den eksakte kretsen node hvorpå motivasjon treffer. Vi har nylig rapportert at, i fly, som hos mennesker, dopamin-nivåene er sentrale for mating stasjon 25, 26, 27. Vi har fått genetisk tilgang til relevant dopamin-produserende og motta nevroner i fly, tilrettelegging detaljert molekylær- og krets-nivå analyser av dette bevart fenomenet ved hjelp av analysene vi beskriver her 25.

Vi legger til atferdsanalyser i Zhang et al. 25 en ny flat atferds arena som gjør at video å score, som vi kaller en to-dimensjonale (2D) satiety analyse, en viktig forbedring i forhold til tidligere metoder. Følgelig er den nye analysen mer skalerbar og kvantifiserbar, og derfor mer egnet for genetiske skjermer av gener og neuroner som er involvert i motivasjon. Vi bruker denne nye analysen, sammen med frieri analyser og neurogemagnetiske manipulasjoner, for å demonstrere hvordan man kan måle og endre parring stasjonen i fly.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Denne protokollen beskriver forberedelsene (§§ 1 - 3), gjennomføring (kapittel 4), og analyse (§ 4) 2-D satiety analyser. Deretter bruker dopaminerg stimulering som eksempel § 5 viser hvordan du kan kombinere thermogenetic stimulering med 2-D satiety analyser for å indusere hyperseksualitet. § 6 beskriver 3 måter å bekrefte resultatene av 2-D satiety analyser. Til slutt, § 7 viser hvordan man kan måle utvinning av parring stasjonen i mannlige fluer.

1. Fabricating 8- og 32-kammer Behavioral Arenas

MERK: Hver atferds arena består av flere lag med laser-cut plast ark som holdes sammen av sekskantskruer og tommel muttere på hver av de fire hjørnene (Figur 1a).

  1. Dikte lagene i arenaen. Fremstille et lag ved hjelp av en laser kutter for å kutte ark av akrylplast til den passende form (se figur 1B, 1C for produkter).
    MERK: Mange forskning institutions har laserkutterne i deres maskin butikker eller trakter mellomrom. Hvis institusjonen har tilgang til en laser cutter, fortsetter du med følgende trinn. Hvis ikke, så følg instruksjonene i trinn 1.2 i stedet.
    1. For hvert lag, åpner design mønster i laser cutter programvare.
      MERK: design kan bli funnet i passende navnet PDF-filer (for eksempel 8-Chamber Arena - Lag 2 - Doors.pdf) i Supplemental Material 1. Denne filen inneholder også merknader til den type plast som skal brukes (for eksempel 1 / 8 tommer (dvs. 3,175 mm) klar akryl). Den nøyaktige tykkelsen på hvert lag er ikke kritisk. Det viktigste kravet er å gi 0,12 inches (3 mm) eller mer av fri vertikal plass i kamrene.
    2. Juster laser innstillinger (strøm, fokus, etc.) for typen og tykkelsen av plast for å bli brukt. Plasser plast i laser cutter seng og kjøre laser cutter.
      MERK: Disse innstillingene vil variere mye basert på laser cutter modell og styrken av sin laser. Finn riktige innstillinger basert på tidligere erfaringer eller ved å gjøre test kutt på skrap plast. De dype sekskantede graveringer er inkludert i utformingen til fordypningen de hex skruehodene. Denne funksjonen gjør det mulig for enhånds innstramming av tommelen nøtter og lar arenaene å hvile flatt på benken (uten utstikkende skruehoder). Ikke desto mindre, noe som gjør dype graveringer er ofte vanskelig å oppnå, og tidkrevende, ved hjelp av en laserskjærer. Dette trinnet er valgfritt, og kan hoppes over uten å påvirke atferds resultater.
    3. Når du skjærer i dørkarmen (Layer 2, figur 1A), også bruke egnede laser innstillinger for graverkammer tallene som inngår i design (som i figur 1B, 1C).
  2. Plasser en bestilling med en online laserskjæring trykkeri. Last opp alle PDF-design-filer for 8- og / eller 32-kammer arena og angi materialtype (for eksempel 1/8 tommer (dvs. 3,175 mm) Clear akryl) basert på kommentarer i filene. Resultatene vises som i figur 1B (8-kammer arena) og 1C (32-kammer arena).
  3. Monter arenaer ved hjelp av fire sekskantskruer og fire tommel nøtter å justere og holde sammen plast lag (Figur 1a). Arenaene vil vises som i figur 1D, 1E (8-kammer) og figur 1F, 1G (32-kammer).
    MERK: mat veggen (lag 4 i figur 1A) benyttes for 2-D metthetsfølelse bare analyser og er utelatt i 32-kammer arenaer, som brukes i frieri analyser.

2. Mat Forberedelse til 2-D satiety analyse

MERK: Fordi en to-D metthetsfølelse assay spenner over 4,5 timer, fly mat brukes i arenaen for å gi næring og vann. Denne protokollen bruker, men er ikke begrenset til, den konvensjonelle maismel-agar fly mat.

  1. Delvis montere den 2-D metthetsfølelse arenaen (8-kammer) med lag 3 - 6(se Figur 1A for lag oppdrag) og trekk den med tommelen nøtter og sekskantskruer.
  2. Plasser fersk flue mat i en ren, mikrobølgeovn-safe flaske. Legg akkurat nok vann til å dekke bunnflaten av flasken (figur 2A).
  3. Mikrobølgeovn mat på høy i 30 - 45 s. Sjekk fremgang og rør hvert 15 s til smeltet (figur 2B). FORSIKTIGHET! Fly mat koker lett over.
  4. Bruk en avstumpet 1000-mL pipette (figur 2C) til sakte overføre ~ 1 ml smeltet mat til hvert kammer (figur 2D).
  5. La maten resolidify ved 4 ° C i ~ 10 min (figur 2E) før helt montering arenaen (figur 2F).
  6. Bruk ferdig arena for eksperimenter (se avsnitt 4) eller oppbevares ved 4 ° C.
  7. Oppbevar matrestene ved 4 ° C og gjenbruk.

3. Klar Virgin Kvinner for Behavioral Analyser

NOTE: 2-D metthetsfølelse assays bruke et stort antall jomfruehunnfluer (~ 120 - 160 for en fullstendig atferds arena) som er vanskelig å samle inn ved hjelp av standardmetoder. Dette avsnittet beskriver en alternativ tilnærming ved hjelp av hs-HID-transgenet i Y-kromosom 28, som har vært brukt med hell i frieri analyser 25, 29. Aksjen brukes til å generere hvite-eyed jomfruelige kvinner har genotypen w1118 (X) / hs-hid (Y); + / + + / + (Bloomington lager nummer 24638).

  1. Flip flyr inn i en ny flaske når 20 - 50% av den puppe har eclosed (se figur 3A for eksempel), og det er nok hanner (5 - 10) for å forplante massen.
  2. Varmesjokkoriginalboksen i et 37 ° C varmt vannbad i en time for å aktivere tilstrekkelig hs-hid for å drepe hanner (figur 3B). Etter varmesjokk, bare kvinner vil ELukk fra disse flaskene, og så vil forbli jomfru inntilanalyser.
    MERK: Kontroller at alle sider av flasken er jevnt oppvarmet (se figur 3A for vannlinjen). Forlenge denne tid i opp til 2 timer dersom en time er ikke tilstrekkelig til å avlive alle hanner.
  3. Isoler innsamlede kvinner i minst 3 d før eksperimenter for å sikre at de er gamle nok til å være seksuelt mottakelig 25, 29.
    MERK: Y-kromosom-mindre hanner av og til oppstår fra denne bestanden. Disse menn har hvite øyne og er upåvirket av varme sjokk fordi de ikke inneholder den hs-HID-transgen. De kan ikke produsere sædceller og kan derfor ikke redusere mottagelighet hos kvinner 30, 31.

4. Gjennomføring og scoret 2-D metthetsfølelse Analyser

MERK: Det er viktig å kontrollere alder av den mannlige fluer som parring disken endres med alderen. Denne protokollen bruker hanner som er 3-4 d gamle 25

  1. Still kuvøse til den ønskede temperatur (for eksempel 23 ° C i standard, RT eksperimenter) og fuktighet (> 30%). For inkubatorer uten fuktighet kontroll, og etterlater en kopp vann i inkubatoren er tilstrekkelig.
  2. Plasser en 2-D metthetsfølelse assay arena i inkubatoren i ~ 30 minutter for å ekvilibrere temperaturen og for å hindre kondensasjon i kamrene i løpet av eksperimentet. De roterende dører skal være i åpen stilling.
  3. Bruk en flue aspirator 32 til å suge 15 - 20 jomfruelige kvinner i hvert kammer av arenaen (figur 4).
    MERK: det er viktig at kvinner og menn ikke er bedøvet på samme dag som analysen. I vår erfaring, kan gjøre det påvirke kvinnelige mottakelighet og mannlig paringsatferd.
  4. Sug en mannlig inn i hvert kammer.
  5. Plasser lastet arena i inkubatoren under et standard videokamera (figur 5) og film i 4,5 timer.
  6. Resultat videoer ved å merke seg når hver mann fly starter og slutter hver parring (dvs. copulation). Dette trinnet kan være tidkrevende i starten. Med praksis, kan man scorer videoene på 5x hastighet eller høyere.
    Merk Fordi fluer mate for ~ 20 minutter ved ~ 23 ° C (varighet kortere ved høyere temperaturer) 29, kan man skumme gjennom de første 15 min av hver enkelt parring.
  7. Når du har logget alle parring ganger, oppsummere antall parringer for hvert fly (se representative resultater).
  8. Bruk den medfølgende koden for å generere en ethogram. Se Supplemental Material 2 for koden, instruksjoner, og eksempel data.
  9. Bruk CO 2 eller kald temperatur for å bedøve fluene før du fjerner dem.

5. Bruk thermogenetic Manipulasjon Reverse Metthetsfølelse i 2-D metthet Analyser

MERK: Denne protokollen tester om thermogenetic stimulering av et definert nevronale befolkningen kan overvinne metthetsfølelse. Den eksperimentelle FLIes uttrykke varmefølsomme cation kanal TrpA1 i definerte populasjoner av nerveceller (UAS-TrpA1). Trinnene nedenfor gjelder for stimulering av dopaminerge nevroner (TH-GAL4), som har vist seg å fremme parring stasjon 25. Disse trinnene kan brukes sammen med andre nevrale drivere for å oppdage andre populasjoner som fremmer parring stasjonen.

  1. Å thermogenetically indusere parring atferd i satiated fluer, øke temperaturen i inkubatoren (for eksempel fra 23 ° C til 28,5 ° C) etter å ha fullført en full 4,5 timer 2-D metthetsfølelse eksperiment.
  2. Etter inkubatoren når ønsket temperatur, fortsetter varmen stimulering og scorer parringer (ie. Copulations) av hannene i 1 t (se Representant Resultater).
    MERK: Temperaturen og lengden på stimulering kan variere avhengig av genotype så det er nødvendig å feilsøke de optimale forhold som hindrer overstimulering av nevroner og likevel produsere en Robust fenotype.

6. Bruk Frieri og Locomotion til Bekreft satiety

MERK: Denne delen beskriver 3 valgfrie metoder som kan brukes til å kontrollere resultatene av 2-D satiety analyser. De er ikke nødvendig for hver analyse.

  1. Bruk frieri analyser for å verifisere metthetsfølelse.
    1. Aspirer en mannlig og en jomfru kvinnelig inn i hver av de 32 kamre i et frieri arena.
    2. Film fluene for ~ 20 min ved hjelp av en standard videokamera.
    3. Resultat frieri index (CI) for å kvantifisere frieri 25; dette er brøkdel av tiden utfører frieri atferd (sang etter, osv.) og parring (dvs. copulation) over en 5 min vindu. Dette vinduet starter fra den første forekomsten av frieri atferd. Hvis en mannlig fly ikke starter frieri i de første 15 min, er dens CI 0. Naive WT fluer bør vise en CI større enn 0,9, mens et fullt mett flue bør ha en CI below 0,2. Andre frieri tiltak kan også vurderes 23, 33.
  2. Scoring frieri i 2-D satiety analyser
    1. Score mengden av tid som en hann flue tilbringer kur til, over et tidsrom på en 2-D metthetsfølelse assay (som den første h). Frieri er definert som den mannlige utføre noen trinn av ritualet (sang etter, etc.). I motsetning til i avsnitt 6.1.3, betyr dette trinnet inkluderer ikke tid den mannlige tilbringer parring.
    2. Del frieri tid over av den totale tiden hannen ble ikke parring (dvs. ikke copulating) i samme periode. For eksempel, hvis en mannlig fly baner for 15 min og mates i 20 minutter i løpet av den første time, er forholdet 15 min / (60 min - 20 min) = 0.375. Forholdet er vist som "Fraction of nonmating tid i frieri" i Representative resultater.
  3. Ved hjelp av bevegelse analyse for å vurdere utmattelse
    1. Delvis montere 32-kammer arena med alle deler, men kontrasten ark.
    2. Sug en mannlig fly (ingen kvinnelige fluer) i hver av de 32 kamre i et frieri arena.
    3. Film fluene for ~ 10 min ved hjelp av en standard videokamera.
    4. Spor fluene med MTrack2 plugin i ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).

7. Gjenopprette Mating Drive etter 2-D satiety analyse

  1. Utføre en 2-D metthet analyse som beskrevet i kapittel 4, men aspirere den mannlige flyr ut ved slutten av analysen.
  2. Isoler de mannlige fluer ved 23 ° C for ønsket antall dager.
  3. Utfør en 2-D satiety analysen med de gjen hanner og scorer sine parringer (dvs. copulations) for bare en time (se Representant Resultater).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å karakterisere Drosophila parring stasjon, tre dager gamle, WT Canton-S-hanner ble testet i en to-D metthetsfølelse analysen. I løpet av analysen (4,5 timer), hanner parer et gjennomsnitt på 4,8 ± 0,3 (middelverdi ± standardavvik av middel, SEM) ganger. Parr initiere for det meste i de første 2 timer (78%) (Figur 6A, 6B) og blir mindre hyppig som analysen utvikler seg (figur 6A, 6B). Denne reduksjonen er ikke på grunn av mangel på sammenpassende partnere (74% hunner forbli uinnstukne gjennom hele analysen) eller fysisk utmattelse (figur 6F). Snarere er denne effekten sannsynligvis forklares ved en nedgang i den mannlige frieri under analysen, fra 42,6 ± 8,0% (gjennomsnitt ± SEM) (1 st h) til 2,0 ± 0,7% (gjennomsnitt ± SEM) (siste time) av nonmating tids (figur 6C). Denne nedgangen i frieri er også sett når hannene er testet i frieri analyser med nye kvinner (figur 6D, 6E) (figur 6G, 6H). Disse resultater viser at internt holdes sammenpassende stasjon i hannfluer kan mett i en 2-D metthetsfølelse analysen og kan gjenopprette over tid.

Den 2-D satiety analysen kan også enkelt kombineres med Drosophila nevrale manipulasjoner. Vi har nylig rapportert at thermogenetic stimulering av dopaminerge nevroner reverserer parring stasjonen i mett mannlige fluer 25. Ved anvendelse av 2-D-metthetsfølelse assays, finner vi at dopaminerg stimulering (TH> TrpA1, 28,5 ° C) ved slutten av metthet analysen økes både frieri (figur 7A, 7C, rød) og kopulasjon (Figur 7A, 7B, rød). Reverseringen effekter er ikke observert med foreldrekontroll genotyper (Figur 7A - 7C, svart og grå). Alle disse resultatene er i overensstemmelse med den siste studien25 og tyder på at 2-D metthetsfølelse analysen, sammen med hjelpe analyser (frieri og locomotion), kan brukes til å dissekere molekylære og nevronale komponenter av parring stasjonen.

Figur 1
Figur 1. Prosjektering og installasjon Behavioral Arenas. En 8-kammer arena (brukes for 2-D satiety analyser) består av 6 lag som holdes sammen av tommel nøtter og sekskantskruer (A). En 32-kammer arena (brukes for frieri assays) fremstilles på samme måte, men uten mat veggen (laget 4). Arenaen deler er skåret ut med en laserskjærer og lagene er nummerert som (B) for 8-kammer og (C) for 32-kammer. De sammenstilte 8-kammer arenaer er vist i (D) (forfra) og (E) (sett fra siden med nummererte lag). De sammenstilte 32-kammer arenaer sammen på en lignende måte (F, G), men lag 4 (mat vegg) er utelatt (G) siden ingen fly mat er i arenaen for frieri analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Klar 2-D metthet Analyser med mat. Standard Drosophila maten er plassert i en mikrobølgesikker krukke med vann (A). Maten er microwaved til smeltet (B). En avstumpet pipettespissen (C, pil) brukes til å overføre mat til kamrene i en delvis montert atferds arena (D). Maten er re-størknet ved 4 ° C (E) før atferds arena er ferdig montert (F).pg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Generering jomfru Kvinner fra w1118 (X) / hs-hid (Y) Stock. Flyr flasker bør være varmesjokkbehandlet ved 50 - 80% av den puppe er uneclosed som indikert ved deres ugjennomskinnelighet (A). Det innfelte bildet viser prøver av uneclosed (øverst) og eclosed (nederst) pupper (A). Flaskene blir tynget ned og nedsenket i 37 ° C varmt vannbad i 1 time med vann-nivå like over bunnen av flaskepropper for å sikre jevn oppvarming (B). Se den svarte pilen i (A) for vannlinjen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"Figur Figur 4: Laster Flyr inn en Behavioral Arena. Forsiktig aspirer og hold 15 - 20 hunner i aspirator (A). Pipettespissen brukes til å åpne den roterende dør (B), og fluene forsiktig slippes inn i kammeret (C). Bruk aspirator for å lukke den roterende dør (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Utføre og ta opp en 2-D satiety analysen. (A) En standard videokamera (a) brukes til å registrere målingen i en inkubator innstilt på den ønskede temperatur. Inkubatoren inneholder en kolbe med vann (b) og en fuktighetsdetektor (c) for å sikrepassende luftfuktighet (> 30%). Den forberedt 2-D metthetsfølelse analysen er filmet under videokameraet (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: metning og gjenoppretting av Fy Mating Drive. I en 2-D metthetsfølelse analysen, mannlige fluer kompis ofte i løpet av de første 2 timene av analysen (A, B), men redusere sine frieri (C) og parringer (B) som analysen utvikler seg. Den progressive nedgang i frieri atferd opprettholdes når menn er overført til et frieri analysen med nye kvinner etter å ha fullført en 2-D satiety analysen av 0 time eller en time, eller 4,5 h (D, E). Røde piler peker til menn stiller frieri og parring atferd, mens oransje arrader peker til ikke-parring, ikke-frierføtter fluer (A, D). Nedgangen i seksuell atferd er ikke et resultat av fysisk utmattelse, som hannene tilsvarende nivåer av lokomotorisk aktivitet før og etter den 2-D metthetsfølelse assay (F). Hanner gradvis gjenopprette sin parring (G) og frieri (H) nivåer i løpet av tre d av isolasjon fra kvinner. I denne figur, *** p <0,001, ** p <0,01, NS ikke signifikant for t-test (C, F) og en-veis ANOVA med Tukey post-test (E, G, H). N = 15 - 16 for hver tilstand for alle forsøk. Feilstolpene representerer standardfeil av middelverdien (SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7: thermogenetic satiety Tilbakeføring i Male Fluer. Som i standard 2-D metthetsfølelse assay, hanner viser en nedgang i parringer i løpet av eksperimentet, men thermogenetic stimulering av dopaminerge nevroner (TH> TrpA1, red), men ikke i foreldre-kontroll genotyper (svart og grått), gjeninnsetter parring stasjonen i satiated menn (A). Ingen parringer er scoret når X-aksen er brutt i (A). Dette reversering av parring stasjonen kan kvantifiseres ved hjelp av enten parring tall (B) eller frieri (C). X-akse tall i (B) og (C) refererer til annen i (A). Orange bakgrunnsfarge indikerer thermogenetic stimulering (A - C). I denne figur, NS ikke signifikant for interaksjon mellom genotypen og temperatur i to-veis ANOVA med Bonferroni post-test (B, C) *** p <0,001,. N = 8 for hver genotype (B, C). Feilfelt representerer SEM..jove.com / filer / ftp_upload / 55291 / 55291fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental Material 1. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplemental Material to. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Motiverende stater kan bli mett, vedlikeholdt, og gjenvunnet 34. Vi presenterer en 2-D satiety analysen som raskt og robust måler alle disse aspektene ved parring stasjonen i fly. Denne analysen åpner opp muligheten for å bruke avanserte flue genetiske manipulasjoner for å studere de molekylære og krets komponenter av en motivert atferd.

Satiety analysen er avhengig av mannens evne til å retten og parre seg, og å avslutte copulations på riktig tidspunkt. Selv hyposexual fluer domstol mindre, lav-frieri fluer er ikke nødvendigvis hyposexual; De kan for eksempel ha problemer med å gjenkjenne eller sporing hunnene 35. Av denne grunn er det metthetsfølelse analysen best egnet for testing hyper en fenotype som ikke kan bli pålitelig observert i en standard assay frieri fordi naive villtype hannene frieri indekser som nærmer seg 1. hyper i den metthetsfølelse assay shOuld bli vurdert i forhold til alderen på manns i vår erfaring, eldre menn har en tendens til å pare seg litt oftere enn de tre dager gamle hanner som brukes her.

Vi brukte thermogenetic stimulering av dopaminerge neuroner for å eksemplifisere de neurogenetic manipulasjoner som kan brukes i dette systemet for å undersøke komponentene liggende motivasjon. I tillegg kan forskerne også bruke thermogenetic stimulering i løpet av en 2-D metthetsfølelse assay og se etter hyper hanner som er langsommere for å nå metthetsfølelse. Selvfølgelig kan metthetsfølelse assays også kombineres med neuronale Silencing verktøy 36, 37, 38, optogenetics genetiske mutasjoner 39, 40, 41, RNAi knockdown 28, 42, 43, 44, etc.

Satiety analysen er rimelig og skalerbar. Hver arena kan produseres for ~ 10 amerikanske dollar i materialer (pluss laser kutte kostnader, hvis noen) og opptar mindre plass enn en pocketbok. Scoring videoene er også en relativt enkel oppgave. En trenet eksperimentator kan score en 4,5 timers video med åtte mannlige fluer i ~ 1,5 time. For mer high-throughput screening, kan man plassere ballen bare de siste 2 timer, når normale fluer viser meget lave nivåer av parring stasjon. Alternativt kan man få øye sjekke analysene hvert 30 min, da dette vil fange de fleste av ~ 20 min lange parringer.

Vi håper dette systemet vil bli mye tilpasset og vil bidra til fremveksten av Drosophila som et kraftig system for å låse opp hemmeligheter til motivasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K12 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/8 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K42 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
3/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8560K219 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/32 inch black delrin McMaster-Carr 8575K132 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
Hex screws, 1 inch long (50x) McMaster-Carr 92314A115  Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas.
Thumb nuts (25x) McMaster-Carr 92741A100 Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr).
Camcorder Canon Vixia HF R700 Can be replaced by any consumer comcorder.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sturtevant, A. H., Bridges, C. B., Morgan, T. H. The spatial relations of genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 5 (5), 168-173 (1919).
  2. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (1985).
  3. Hall, J. C. Systems Approaches to Biological Rhythms in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 61-185 (2005).
  4. Luo, L. Rho GTPases in neuronal morphogenesis. Nature reviews. Neuroscience. 1 (3), 173-180 (2000).
  5. Schmucker, D., Clemens, J. C., et al. Drosophila Dscam Is an Axon Guidance Receptor Exhibiting Extraordinary Molecular Diversity. Cell. 101 (6), 671-684 (2000).
  6. Jan, Y. N., Jan, L. Y. HLH proteins, fly neurogenesis, and vertebrate myogenesis. Cell. 75 (5), 827-830 (1993).
  7. Stockinger, P., Kvitsiani, D., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121 (5), 795-807 (2005).
  8. Yu, J. Y., Kanai, M. I., Demir, E., Jefferis, G. S. X. E., Dickson, B. J. Cellular Organization of the Neural Circuit that Drives Drosophila Courtship Behavior. Current biology. 20 (18), 1602-1614 (2010).
  9. Zhou, C., Pan, Y., Robinett, C. C., Meissner, G. W., Baker, B. S. Central Brain Neurons Expressing doublesex Regulate Female Receptivity in Drosophila. Neuron. 83 (1), 149-163 (2014).
  10. Rideout, E. J., Dornan, A. J., Neville, M. C., Eadie, S., Goodwin, S. F. Control of sexual differentiation and behavior by the doublesex gene in Drosophila melanogaster. Nature neuroscience. 13 (4), 458-466 (2010).
  11. Manoli, D. S., Foss, M., Villella, A., Taylor, B. J., Hall, J. C., Baker, B. S. Male-specific fruitless specifies the neural substrates of Drosophila courtship behaviour. Nature. 436 (7049), 395-400 (2005).
  12. Kimura, K. I., Ote, M., Tazawa, T., Yamamoto, D. Fruitless specifies sexually dimorphic neural circuitry in the Drosophila brain. Nature. 438 (7065), 229-233 (2005).
  13. Cachero, S., Ostrovsky, A. D., Yu, J. Y., Dickson, B. J., Jefferis, G. S. X. E. Sexual dimorphism in the fly brain. Current biology. 20 (18), 1589-1601 (2010).
  14. Clowney, E. J., Iguchi, S., Bussell, J. J., Scheer, E., Ruta, V. Multimodal Chemosensory Circuits Controlling Male Courtship in Drosophila. Neuron. 87 (5), 1036-1049 (2015).
  15. Kallman, B. R., Kim, H., Scott, K. Excitation and inhibition onto central courtship neurons biases Drosophila mate choice. eLife. 4, e11188 (2015).
  16. von Philipsborn, A. C., Liu, T., Yu, J. Y., Masser, C., Bidaye, S. S., Dickson, B. J. Neuronal control of Drosophila courtship song. Neuron. 69 (3), 509-522 (2011).
  17. Zhou, C., Franconville, R., Vaughan, A. G., Robinett, C. C., Jayaraman, V., Baker, B. S. Central neural circuitry mediating courtship song perception in male Drosophila. eLife. 4, e08477 (2015).
  18. Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila. Neuron. 69 (3), 498-508 (2011).
  19. Kohatsu, S., Yamamoto, D. Visually induced initiation of Drosophila innate courtship-like following pursuit is mediated by central excitatory state. Nature Communications. 6, 6457 (2015).
  20. Fan, P., Manoli, D. S., et al. Genetic and neural mechanisms that inhibit Drosophila from mating with other species. Cell. 154 (1), 89-102 (2013).
  21. Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
  22. Ejima, A., Smith, B. P. C., et al. Generalization of Courtship Learning in Drosophila Is Mediated by cis-Vaccenyl Acetate. Current Biology. 17, 599-605 (2007).
  23. Keleman, K., Vrontou, E., Krüttner, S., Yu, J. Y., Kurtovic-Kozaric, A., Dickson, B. J. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489 (7414), 145-149 (2012).
  24. Pan, Y., Baker, B. S. Genetic Identification and Separation of Innate and Experience-Dependent Courtship Behaviors in Drosophila. Cell. 156 (1-2), 236-248 (2014).
  25. Zhang, S. X., Rogulja, D., Crickmore, M. A. Dopaminergic Circuitry Underlying Mating Drive. Neuron. 91 (1), 168-181 (2016).
  26. Bowers, M. B., Van Woert, M., Davis, L. Sexual behavior during L-dopa treatment for Parkinsonism. The American journal of psychiatry. 127 (12), 1691-1693 (1971).
  27. Sacks, O. W. Awakenings. , Vintage Books. New York. (1999).
  28. Dietzl, G., Chen, D., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  29. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing dopaminergic and GABAergic neurons control the duration and persistence of copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
  30. Peng, J., Chen, S., Busser, S., Liu, H., Honegger, T., Kubli, E. Gradual Release of Sperm Bound Sex-Peptide Controls Female Postmating Behavior in Drosophila. Current biology. 15 (3), 207-213 (2005).
  31. Yapici, N., Kim, Y. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
  32. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36 (36), 1-5 (2010).
  33. Cook, R., Cook, A. The Attractiveness to males of female Drosophila melanogaster: effects of mating, age and diet. Animal behaviour. 23, 521-526 (1975).
  34. Toates, F. M. Motivational Systems (Problems in the Behavioural Sciences). , (1986).
  35. Hall, J. C. The mating of a fly. Science. 264 (5166), 1702-1714 (1994).
  36. Simpson, J. H. Mapping and manipulating neural circuits in the fly brain. Advances in genetics. 65 (9), 79-143 (2009).
  37. Venken, K. J. T., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic Manipulation of Genes and Cells in the Nervous System of the Fruit. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
  38. Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  39. Bellen, H. J., Levis, R. W., et al. The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes. Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).
  40. Spradling, A. C., Stern, D., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153 (1), 135-177 (1999).
  41. Parks, A. L., Cook, K. R., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36 (3), 288-292 (2004).
  42. Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nature reviews. Genetics. 6 (3), 179-193 (2005).
  43. Ni, J. Q., Liu, L. P., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  44. Ni, J. Q., Zhou, R., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature. 8 (5), 405-407 (2011).

Tags

Neuroscience motivasjon Mating stasjon, Dopamin Frieri Behavior
Måle og endre Mating Drive i Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boutros, C. L., Miner, L. E., Mazor, … More

Boutros, C. L., Miner, L. E., Mazor, O., Zhang, S. X. Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (120), e55291, doi:10.3791/55291 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter