Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الفرز البيئي هيدروفيلا Aeromonasو بكتريا spp. و القط بسيودوكابيلاريا في "نظم الزرد"

Published: December 8, 2017 doi: 10.3791/55306
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biological Research Facility, The Francis Crick Institute

Summary

ويصف هذا البروتوكول استخدام مسحات مستنقع وحماه تحليل نظم الزرد، الذي يؤدي إلى الكشف عن زيادة مقارنة باستخدام الوحيد من الحراس للكشف عن مسببات الأمراض مثل هيدروفيلا Aeromonasو بكتريا spp. القط بسيودوكابيلاريا. ويقترح أيضا إنشاء نظام لرصد القط P. البيض في الحجر الصحي.

Abstract

وضع نظم رصد الصحة والمستخدمة في مرافق البحوث الزرد نظراً للعوامل الممرضة من دانيو rerio مثل هيدروفيلا Aeromonasو بكتريا spp. و القط بسيودوكابيلاريا لديها القدرة على تضر بالرفق بالحيوان والبحوث. الأسماك هي عادة تحليل بعد الوفاة للكشف عن الميكروبات. استخدام الحراس وسيلة مقترحة لتحسين حساسية الترصد وخفض عدد الحيوانات عينة. ويرد وصف الإعداد من خزان الترشيح قبل الحارس خارج نظام مغلق. تم تطوير التقنية لمنع تلوث المياه وتمثل السكان الأسماك من اختيار دقيق للعمر ونوع الجنس، وسلالات. من أجل استخدام الحد الأدنى لعدد الحيوانات، ترد أيضا تقنيات فحص البيئة. يستخدم بوليميريز "سلسلة من ردود الفعل" (PCR) على سطح مستنقع مسحات لتحسن بشكل كبير في الكشف عن بعض الأنواع المتفطرات انتشارا والمسببة للأمراض مثل بكتريا فورتويتومو بكتريا هايموفيلوم بكتريا كلوني. طريقة بيئية أخرى تتكون من معالجة الحمأة في أسفل دبابة عقد أو مستنقع للبحث عن البيض القط P. . هذا هو أسلوب رخيصة وسريعة يمكن تطبيقها في الحجر الصحي حيث هو جهاز تربية مغمورة في خزان القابضة للحيوانات المستوردة. وأخيراً، PCR يتم تطبيقه على العينة الحمأة وهو الكشف عن هيدروفيلا (أ) في القاع والسطح في مستنقع. عموما، هذه التقنيات الفرز البيئي المطبقة على هذه العوامل الممرضة محددة أدت إلى زيادة حساسية مقارنة باختبار الترشيح قبل الحراس.

Introduction

من أجل حماية البحوث والرفق بالحيوان1،2، يرصد وجود مسببات الأمراض داخل مرافق الحيوانات. وفي حالة الزرد، الصحة رصد3،4،5،،من67،،من89،10،11 غالباً ما تعتمد على الحيوانات التي تم تحليلها بعد الوفاة بالتشريح المرضى، وثقافة علم الجراثيم، أو الأساليب الجزيئية. اختبار فقط مستعمرة الحيوانات ليس الأسلوب المستحسن نظراً للعدد من الأسماك والمصروفات ذات الصلة التي ستكون مطلوبة للكشف عن مسببات أمراض انتشار المنخفض. ولذلك، الأسلوب المفضل للكشف عن مجموعة صغيرة من الحيوانات لحمولة أكبر من الملوثات. وتسمى هذه الأسماك الحراس قبل الترشيح. ويستمر هذا التعرض لأشهر وأنه ينطوي على زيادة في عبء العمل لمقدمي الرعاية الحيوانية و/أو بعض الحلول الهندسية بنيت لهذا الغرض. تحد آخر وهو فحص خطوط المستوردة في الحجر الصحي فيها الحيوانات الخصبة بأن تبقى على قيد الحياة، وهذا غير متوافق مع فحوصات روتينية على جثث.

يصف لنا هنا بعض الطرق للكشف عن بعض العوامل الممرضة الزرد (ألف-هيدروفيلا، متفطره spp.، و عين القط) بفحص البيئة المائية للنظام. ويهدف إلى الحد من عدد الأسماك المستخدمة لرصد الصحة وتحسين دوران، والتكلفة، وحساسية للكشف عن. هذه الأساليب بديل لاستخدام الحيوانات، ويمكن تطبيق بعض التقنيات لفحص الواردات في الحجر الصحي. على سبيل المثال، موتشو9 كان قادراً على تحديد أكثر الأنواع المتفطرات المسببة للمرض عن طريق إجراء PCR على مسحات مستنقع بدلاً من الزرد (بما في ذلك الحراس)، وتم الحصول على هذه مع عينات أقل. في ذلك نفس الدراسة، تم الكشف عن البيض القط P. مع أكثر حساسية بفحص خزان الحمأة استخدام التعويم والفحص المجهري بدلاً من اختبار الأسماك بكر والأنسجة.

ويلخص الجدول 1 السمات المختلفة للحارس البرامج3،4،5،،من67،،من89،10 المستخدمة من قبل عدد من مرافق الزرد. تلقي الحراس بعد ترشيح المياه بنفس الطريقة كأي سمكة مستعمرة بينما الحراس الترشيح قبل تلقي المياه مرة واحدة قد تعمم عن طريق أحواض الأسماك مستعمرة أولاً. على سبيل المثال، يمكن تعيين الحراس قبل الترشيح في نظام مغلق باستمرار تلقي مستنقع الماء. وهذا قد لا تكون خياراً عند هناك العديد من الأنظمة المستقلة في غرفة واحدة. وفي هذه الحالة، يمكن استخدام خزان واحد من الحراس قبل الترشيح شاشة الغرفة بأكملها. الحراس في خزان ثابت، والخروج من نظام مغلق، وتغير الماء بانتظام، باستخدام فقط قبل تنقية المياه أيمياه مستنقع من جميع النظم في الغرفة. هذا الأسلوب الموصوفة أدناه كأساس للمقارنة مع كفاءة الفرز البيئي. تم تصميم الهيكل المقترح للتحكم في المسائل المتعلقة بنوعية المياه مثل انخفاض درجة الحموضة أو تلوث نيتروجين.

مفهوم الفرز البيئي الجرثومي يعتمد على فرضية أن البكتيريا قابلة للاكتشاف في بيوفيلم مثل التي وجدت على الحائط مستنقع على سطح الماء أو الحمأة في الجزء السفلي من دبابة. مستنقع يبدو نقطة أخذ عينات مثالية في نظام مغلق لتربية الأحياء المائية نظراً لأنها تقوم بجمع النفايات (الماء والبراز والأعلاف وغيرها من المواد العضوية) من جميع الدبابات قبل الترشيح. سطح مستنقع في كثير من الأحيان يمكن الوصول إليها بسهولة وينظف بسرعة، ويمكن أداؤها أسيبتيكالي لتجنب التلوث عبر العينة (من القفازات على سبيل المثال). ويستخدم المفهوم تحديد spp. بكتريا المسببة للأمراض السائدة في الزرد نظم9،12. ويرد أدناه وصف التقنية ونحن أيضا الإبلاغ عن الكشف عن هيدروفيلا (أ) في مستنقع الزرد مسحات السطحية والحماة.

الفرز البيئي لبيض الطفيلي يستند إلى الكشف عن موراي et al. 13 وتقنية التعويم يستخدم بشكل روتيني لعلم الطفيليات والفحص المجهري لبيض الطفيلي في البراز14. موتشو9 اقترح بديل لعملية أخذ العينات، وأظهرت أن هذه التقنية يمكن أن تستخدم للكشف عن أنواع أخرى من الأسماك [بيوتوب]. المصابة ريريو دال- تمرير القط P. البيض مع فضلاتها وتظل بيض الطفيلي في الجزء السفلي من الخزان، في الرواسب. ويمكن جمعها هناك سبب كثافتها أكبر من الماء. كثافة البيض يستخدم لمعالجة العينات البيئية أيضا. تعويم أولى مع الطرد المركزي يفصل الماء والحطام الخفيفة من أثقل من هذه المسألة. الطرد المركزي ثاني يعتمد على حل السكر المشبعة (بكثافة أكبر من كثافة البيض القط ب. ) للسماح لبيض الطفيلي في الظهور على سطح الأنبوب.

ويمكن الجمع بين فحص للبكتيريا في بيوفيلم و القط P. من الجزء السفلي من الخزان عن طريق إجراء PCR لجميع هذه الجراثيم في الرواسب عينة الحمأة التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي الأول. وهذا يحسن وقت أخذ العينات. يرد أدناه وصف الأسلوب. ونقترح أيضا لاستخدام هذه التقنيات في سياق الحجر صحي. إلى شاشة الزرد الكبار المستوردة التي تحتاج أن تبقى على قيد الحياة، وإدراج جهاز تكاثر إلى خزان الحجر الصحي. بعد أسبوع واحد، هي جمع البراز وغيرها من مواد النفايات في جهاز التكاثر وفرزهم بالفحص المجهري أو PCR. ويرد أدناه وصف التقنية وتم الكشف عن بعض البيض القط ب. بالفحص المجهري في هذا السياق.

Protocol

1-التعرض للترشيح قبل الحراس خارج نظام مغلق

  1. تعيين دبابة ل 8 نظيفة خارج نظام مغلق. املئه بالمياه القادمة من بواليع. إضافة 2 حبات السيراميك أو الأسفنج مكعبات من الوسائط الحيوية من النظم على الشاشة (الشكل 1). إضافة/L ريريو دال-1-2 (أي، الأسماك 12). استخدام الأسماك البرية نوع من الخلفية الوراثية الغالبة في المرفق، وعلى سبيل المثال ab.
    1. حدد على الأقل 6 الأسماك كما يلي: أنثى واحدة على الأقل وأنثى واحدة دون 6 أشهر من العمر وذكر واحد وأنثى واحدة بين 6 و 18 شهرا، وذكر واحد وأنثى واحدة فوق سن 18 شهرا.
  2. تغذية مرة واحدة في يوم. تختلف الوجبات الغذائية (مثلاً، النظام الغذائي الجافة، الماء المالح الروبيان) للتأكد من الحراس معرضون لجميع الوجبات الغذائية المستخدمة في المرفق الزرد. تغيير المياه في يوم الاثنين والأربعاء والجمعة، أيثلاث مرات في أسبوع لمدة 4 أشهر.
    1. لإجراء تغيير المياه الحيوية-وسائط الإعلام ونقل الحراس إلى خزان مؤقت. فارغة تماما في خزان الحارس وتنظيفه. إعادة ملء خزان الحارس بمستنقع الماء فقط. وضع الحراس والوسائط الحيوية مرة أخرى.
  3. تعرض الحراس لمدة 4 أشهر إلى مستنقع الماء. Euthanize الأسماك بأسلوب معتمدة مثل الانغماس في حلاً جرعة زائدة من 2-فينوكسيثانول (3 مل/لتر).
  4. لتأكيد الوفاة، انتظر لمدة 10 دقائق بعد توقف حركة أوبيركولا.
    1. الاستيلاء على الجثث بالملقط وتجميدها تماما في-80 درجة مئوية في حاوية التي تم تحديدها. سيتم استخدام هذا لبكر12،15.
    2. بدلاً من ذلك، قطع تايلات سويقة والذيلية، نك جدار البطن، وتعيين في 4% فورمالين.
      تحذير: استخدام قفازات والأبخرة مجلس الوزراء للأنسجة. قم بتسمية حاوية العينات.

2-مستنقع مسحات

  1. استخدم مسحه جافة عقيمة مع رمح بلاستيكية. ارتداء القفازات. موقع السطح لمسحه (مستنقع الجدار على سطح الماء) وإزالة أي بند منع الوصول بسهولة إلى السطح. اختر على سطح مستنقع مع التدفق المنخفض.
  2. إشهار المسحة عن طريق إزالة التغليف الخارجي ويعرض تلميح القطن المعقمة للهواء. تجنب التلوث المتبادل للمسحة بها مع الحرص على عدم لمس الأسطح التي لم يتم اختبارها.
    1. مسحه مستنقع الجدار أكثر من 5-10 سم لامتصاص المياه وبيوفيلم في مستنقع منسوب المياه السطحية.
    2. غمد مسحه مرة أخرى أو اقتحام الطرف أنبوب الطرد مركزي عقيمة. قم بتسمية العينة وإرسال لاختبار PCR أو تجميد في-80 درجة مئوية.

3-الكشف عن البيض P. القط في الجزء السفلي من دبابة

  1. تحليل الحمأة بالفحص المجهري
    1. استخدام المحاقن 60 مل9 لنضح الحمأة في الجزء السفلي من مستنقع أو دبابة أي عقد الأسماك بما في ذلك الحراس. تقسيم العينة إلى أنابيب 15 مل. إغلاق الأنابيب مع على قمم المسمار وتسمية هذه الأنابيب.
    2. إعداد حل السكر المشبعة (الثقل النوعي = 1.27) عن طريق خلط 227 غرام من حبيبات السكر في 177 مل ماء الساخن مع محرض مغناطيسي14.
    3. الطرد المركزي أنابيب 15 مل في ز x 175-250 لمدة 10 دقائق في أجهزة الطرد مركزي مع دلاء سوينغ. صب الأنابيب وتبقى الرواسب في هذه الأنبوبة.
    4. تملأ هذه الأنابيب في منتصف الطريق مع الحل السكر المشبعة. إغلاق الأنابيب مع على رأس المسمار ومزيج دقيق الرواسب مع الحل.
    5. ضع الأنابيب في دلاء سوينغ أجهزة الطرد المركزي وتملأ بمحلول السكر المشبعة إلى الأعلى. تعيين واحد تغطية الزجاج بلطف على رأس كل أنبوبة واتصال مع الحل السكر المشبعة.
    6. أجهزة الطرد المركزي في 175-250 x ز عن 10 دقيقة علما بأن بعض الزجاج غطاء قد تقع وكسر أثناء الطرد المركزي ومن ثم أنابيب 4 لكل عينة 60 مل. رفع زجاج الغطاء ووضعه على شريحة زجاجية. تسمية الشريحة مع قلم رصاص أو علامة.
      1. في حالة حدوث كسور الزجاج غطاء كثيرة جداً، تملأ معظم الأنبوب مع محلول السكر المشبعة، أجهزة الطرد المركزي في ز x 175-250 لمدة 10 دقائق، وتملأ إلى الأعلى مع الحل السكر المشبعة، ثم تعيين زجاج الغطاء برفق. انتظر لمدة 30 دقيقة.
    7. البحث عن البيض القط P. مع مجهر13 (الشكل 2 و الفيديو 1). تحديد المقابس القطبين في التكبير 400 X6.
      ملاحظة: حجم البيض هو 57-78 ميكرومتر طويلة و 27-39 ميكرون قطرها16،17. ملاحظة أن الشريحة إيجابي واحد يكفي للعينة 60 مل يعلن إيجابية.
  2. استيراد الفحص الحيوانات في الحجر الصحي للبيض القط ب.
    1. تعيين الذكور والإناث ريريو دال في دبابة. إضافة إلى الخزان جهاز يستخدم عادة للحصاد والحفاظ على البيض الناتجة ولكن استخدامه هنا لجمع البراز (الشكل 3).
      ملاحظة: على سبيل المثال، خزان تربية 1 لتر كامل (الخارجي للدبابات والدبابات الداخلية مع أسفل المبشور) تماما غارقة في خزان ل 13، والسماح بحرية الوصول للأسماك للتحرك داخل وخارج الجهاز تربية.
    2. إزالة الجهاز تربية بعد أسبوع واحد وحصاد الحمأة التي تم جمعها في جهاز التكاثر كما هو موضح في الخطوة 3.1 "تحليل الحمأة بالفحص المجهري."

4-بكر على الرواسب والحمأة

  1. نضح الحمأة في أسفل دبابة أو مستنقع مع المحاقن 60 مل9 ونقل العينة إلى أنبوب 60 مل. إغلاق الأنبوب بقمته المسمار وتسمية الأنبوب. التخلص من المحاقن.
  2. هز الأنبوبة 60 مل ونقل 15 مل إلى أنبوب 15 مل. إغلاق الأنبوب بقمته المسمار وتسمية الأنبوب.
  3. الطرد المركزي الأنبوبة 15 مل في ز x 175-250 لمدة 10 دقائق في أجهزة الطرد مركزي مع دلاء سوينغ. صب الأنابيب وتبقى الرواسب في الأنبوب.
  4. إشهار مسحه عن طريق إزالة التغليف الخارجي ويعرض تلميح القطن المعقمة للهواء. تجنب التلوث المتبادل للمسحة بها مع الحرص على عدم لمس الأسطح التي لم يتم اختبارها.
    1. مسحه الرواسب في أنبوب لمدة 15 ثانية.
    2. غمد مسحه مرة أخرى أو اقتحام الطرف أنبوب الطرد مركزي عقيمة. قم بتسمية العينة وتجميد في-80 درجة مئوية وإرسال لاختبار PCR.
      ملاحظة: 45 مل تبقى في أنبوب 60 مل. هذا يمكن الاحتفاظ للكشف عن البيض P. القط بتحليل الرواسب بالفحص المجهري كما هو موضح في الخطوة 3-1، على سبيل المثال، لتأكيد نتيجة PCR. يمكن أن يحاكم PCR في الحمأة لفحص الحيوانات المستوردة بعد الخطوة 3، 2.

Representative Results

فوائد مسحات مستنقع لتحديد أنواع بكتريا انتشارا مقارنة لعينات من الأسماك التي تدعمها النتائج في الشكل 4. الأسماك 115 اختبارها، كلوني م. و . م. هايموفيلوم تم الكشف عن 5 في المائة و 3 في المائة من العينات، على التوالي. تم تحديد لا الأنواع المتفطرات الأخرى المسببة للأمراض. من نظم نفسه، 49 مستنقع مسحات كشفت عن وجود 5 أنواع المتفطرات. وتحسب نسبة الرجحان مع الفرضية القائلة بأن كلوني م. و . م. فورتويتوم يتم الكشف عن أكثر تواترا من بكر في مسحات مستنقع السطحية من عينة الأسماك. هذا يعتد به إحصائيا مع نسبة الرجحان كل منهما من 11 (CI 95%: 4 إلى 29؛ ف < 0.0001) و 306 (CI 95%: 18 إلى 5208؛ p = 0.0001). وتبين النتائج أن تقنية مسحه مستنقع السطحية بديلاً قيماً للاستخدام الوحيد للحراس للشاشة مرفق الزرد بكتريا spp. واستخدمت أيضا عينات بيئية للشاشة هيدروفيلا (أ). تم اكتشاف هذه البكتيريا في الأسماك، الحمأة، والعينات السطحية (الشكل 4). وهذا يؤيد أيضا قدرة التقنيات المقترحة على الشاشة الأسماك [بيوتوب].

فيما يتعلق بتحليل الرواسب للكشف عن البيض القط P. ، اكتشف موتشو9 الطفيلي في 27 في المائة من العينات السمكية بكر والتشريح المرضى حين تم الكشف عن البيض في 93% حماة تم تحليلها من نفس النظام. وهنا طعن التقنية إعادة فحص الحجر الصحي. وفي هذا السياق، لا يمكن أخذ عينات الحيوانات المستوردة، وتقييم حالتهم الصحية في الوقت مناسب يساعد في إدارة الأمن البيولوجي. الأسماك للحالة الصحية غير معروف من منشأة القط P. إيجابية تم تعيينها في الدبابات 8 مع تكاثر الأجهزة: الحد الأقصى للدبابات الأسماك/13 ل 16، 7 المعدلة وراثيا وخط نوع البرية 1، مختلطة بين الجنسين، الذين تتراوح أعمارهم بين 4-24 شهرا. كان حصادها من الأجهزة بعد أسبوع واحد من الحمأة وتحليلها بواسطة الفحص المجهري. بيض القط P. شوهدت في 7 عينات (88 في المائة). وأخيراً، كان بكر كشف الطفيلي تجربته في مستنقع مسحات والرسوبيات والحمأة. 4 من أصل 6 عينات الحمأة PCR إيجابيا وكانت جميع النتائج السلبية مسحات السطحية. وهذا ليس من المستغرب نظراً لفحص الحمأة يعتمد على قدرة البيض على تقع في الجزء السفلي من الخزان. وهذا يوضح أنه يمكن استخدام تقنيات تحليل الحمأة الشاشة ريريو دال- أحواض للإصابة القط ب. وأن الأساليب التي يمكن تكييفها لفحص الحيوانات المستوردة.

Figure 1
رقم 1: خزان الترشيح قبل الحارس خارج نظام مغلق. دبابة ل 8 يملأ مع المياه والحيوية-وسائط الإعلام من بواليع للنظم على الشاشة. الجلوس الخرز بيو السيراميك الأبيض-وسائط اثنين في الجزء السفلي من الخزان (في وسط الصورة). السمك 12 تم تحديدها وفقا لسنهم، والسلالة، ونوع الجنس، وإضافتها إلى خزان الحارس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: البيض القط P. الكشف عنها أثناء تحليل الحمأة بواسطة الفحص المجهري. وكان التكبير المستخدمة 400 X. تشير الأسهم إلى المقابس القطبين. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تربية الجهاز تغمرها المياه في خزان أسماك عقد لجمع الحمأة للتحليل- ويقع هذا الخزان على مقاعد البدلاء غرض الصورة؛ فإنه يتم تعيين خلاف ذلك في نظام مغلق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: النسبة المئوية للتعرف على متفطره spp.، هيدروفيلا (أ)، و القط P. ببكر في الأسماك، السطحية مسحات مستنقع، ومستنقع الوحل. يتم الحصول على النسبة المئوية بقسمة عدد النتائج الإيجابية لكل نوع من الأنواع الممرض عدد العينات المختبرة. النسبة المئوية للنتائج الإيجابية التي تعطي حسب نوع العينة كالأسماك أو السطحية، أو الحمأة، وذكرت بعد اسم هذه البكتيريا. تم اختبار الأسماك 115 و 49 مستنقع السطحية مسحات من بكر للتعرف على متفطره spp. يتم تصنيف البيانات مع النتائج9 موتشو لأنها امتداداً لهذه الدراسة. الأسماك هي الحراس أساسا قبل الترشيح وفقا للمادة 1 من البروتوكول. نادراً ما، عندما الحراس لم تكن متاحة، الهاربين والمستعمرة القديمة الأسماك (> 18 شهرا) تم أخذ عينات منها. تم اختبار جميع الأنظمة المختبرة بكتريا spp. على مسحات الأسماك ومستنقع. وتحسب نسبة الرجحان مع الفرضية القائلة بأن كلوني م. و . م. فورتويتوم يتم الكشف عن أكثر تواترا من بكر في مسحات مستنقع السطحية من عينة الأسماك. هذا يعتد به إحصائيا مع نسبة الرجحان كل منهما من 11 (CI 95%: 4 إلى 29؛ ف < 0.0001) و 306 (CI 95%: 18 إلى 5208؛ p = 0.0001). بكتريا مارينوم PCR كانت سلبية بالنسبة لجميع العينات، وهو لذلك تعتبر غائبة من هذه المرافق ولم تدرج في التحليل. تم اختبار الأسماك 12 و 14 مستنقع السطحية مسحات الحمأة مستنقع 6 ببكر لوجود هيدروفيلا (أ). تم اختبار بواليع 6 لوجود القط P. على السطح وفي الرواسب. بكر = تفاعل البوليميراز المتسلسل. CI = فاصل الثقة. * و * * تشير إلى دلالة إحصائية؛ مقارنات أخرى لم تكن ذات دلالة إحصائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Video 1
الفيديو 1: المسح الضوئي لبيض من القط P. مع المجهر. الشريحة يتم الحصول عليها من تحليل الحمأة كما هو موضح في الخطوة 3، 1. يتم تفحص المجال للكشف عن بيض من القط P.. حالما يتم التعرف على بنية، هو أسرع إلى تأكيد تحديد دقة أعلى. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

المؤلف العمر عند بدء التعرض طول مدة التعرض العمر أخذ العينات قبل أو بعد
الترشيح		 نوع الجنس Strain(s)
بارتون et al. 3 4 أشهر 6 أشهر 10 أشهر مرحلة ما قبل الترشيح N/A N/A
بورخيس et al. 4 6 أشهر 6 أشهر 12 شهرا مرحلة ما قبل الترشيح N/A نوع البرية AB
كوليمور et al. 5 الشباب قدر الإمكان 3 أشهر < 6 أشهر مرحلة ما قبل الترشيح N/A N/A
غايسلر et al. 6 4 أشهر 4 أشهر 8 أشهر قبل وبعد
الترشيح		 N/A نوع البرية AB
ليو et al. 7 3 أشهر 1-6 أشهر 4-9 أشهر قبل وبعد
الترشيح		 N/A نوع البرية
مارتينز et al. 8 3 أشهر 3 أشهر 6 أشهر مرحلة ما قبل الترشيح N/A نوع البرية
موتشو9 < 6 أشهر،
6-12 شهرا،
> 18 شهرا		 4 أشهر 7-24 شهرا مرحلة ما قبل الترشيح 1 أنثى و
1 ذكر من
كل فئة عمرية		 نوع البرية AB
موراي وآخرون 10 3-4 أشهر 3 أشهر، 6 أشهر، سنة 1 7 و 10 و 16
أشهر		 قبل وبعد
الترشيح		 N/A نوع البرية AB

الجدول 1: مقارنة إعدادات الحارس في مرافق الزرد. يمكن تحديد السمك الحارس وفقا على السن أو الجنس أو السلالة. فهي تتعرض لفترة زمنية محددة ويحصلون على نظام ما قبل أو بعد تنقية المياه. يتم تصنيف البيانات من عام 2016 العدد الخاص على الصحة من الزرد اليومية3،4،5،6،،من78،9، 10.

Discussion

القيود المفروضة على التقنيات، خطوات حاسمة، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:

عدم توحيد السن والجنس، والسلالة، وطول مدة التعرض للحراس. وهذا يظهر في الجدول 1. وهناك القليل جداً فحص الأسماك دون 6 أشهر من العمر، أو الأسماك الذين تتراوح أعمارهم بين. قد يكون هناك بعض مسببات الأمراض التي تؤثر على صغار الأسماك كما أن هناك بعض العوامل الممرضة التي أكثر انتشارا في كبار السن السكان10،18،،من1920. وبالمثل، لا يعتبر الفوارق بين الجنسين في اختيار بعض المجموعات الحارس على الرغم من بعض تقرير أن هناك تحيز جنساني لبعض مسببات الأمراض21. يحاول هذا الأسلوب المقترح لمعالجة هذه القضايا، على الرغم من أن من الممكن اختيار السلالة وفقا ممرض محددة لرصد. على سبيل المثال، يمكن أن تساعد تو مع الكشف عن بكتريا spp.12،22، ولكن هناك خطر أن الحراس ثم تعمل كعلامات سريرية الخزان أو عرض. نهج مركز الموارد الدولي الزرد10 فيما يتعلق بطول مدة التعرض، يزيد من فرص للكشف عن مسببات الأمراض التي يمكن أن تضيع بفترة غير كافية من تلوث. ويعني الحاجة إلى التعرض لفترة طويلة أن الحراس ليست متاحة بسهولة. إضافة العينات البيئية يتيح بعض المرونة وتعدد أحداث الفرز. على سبيل المثال، أخذ العينات يمكن أن تتم كل شهرين مع فاصل 4 أشهر بين كل أسلوب الفرز. وهذا قد يقلل من انقضاء فترة من الوقت قبل أن يتم الكشف عن مسببات الأمراض المستحدثة.

الاعتماد على تقنيات الفرز البيئي في الكشف عن مسببات الأمراض في البيئة. مسببات الأمراض يلقي بالسمك والمخفف لذلك في نظام المياه. وكان لم تستكشف إمكانية التقاط مسببات الأمراض ب تنقية المياه23 . الأساليب التي يمكننا وصف فعالة فقط إذا توفرت العوامل الممرضة ما يكفي من الوقت للتكاثر في الأسماك وبيوفيلم للوصول إلى الحد الأدنى للسماح بالكشف عن التلوث. يتم تصغير هذا القيد من التقنيات بمجموعة حاسمة من مواقع أخذ العينات: يتم أخذ عينات الحمأة في الخزان بدلاً من الحمأة مستنقع، وأخذ عينات المياه وبيوفيلم في السطح في مستنقع وليس في دبابة أو الترشيح بعد. ومع ذلك، جميع العينات المأخوذة من نفس النظام من المحتمل أن تعطي النتائج نفسها. يمكن تأكيد النتائج الإيجابية عين القط باستخدام مقايسة أخرى (التشريح المرضى أو بكر أو تحليل الرواسب). يمكن تأكيد نتائج إيجابية PCR المتفطرات بالثقافة أو بواسطة آخر التشخيص المختبري. بيد عند تأسيس مركز صحة، كذلك هي أوصت العينات للتأكد من النتائج السلبية من أي أسلوب الفرز البيئي.

أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بالأساليب القائمة البديلة:

متفطره spp. شائعة في البيئة ووجودهم في مستنقع لا يتنبأ على الإمراضية12. موتشو9 أظهرت أن رصد معدلات الوفيات هو المفتاح لدراسة تطورات القضايا الصحية. ولا يزال استخدام العينات الحيوانية ضرورية لأي تحقيق الطب البيطري. رصد الصحة يعني الكشف عن جميع مسببات الأمراض انتشارا في منشأة وهذا لا يمكن تحقيقه باستخدام تقنيات الفرز البيئي الوحيد. ومع ذلك، عدم وجود حساسية أدوات التشخيص يمكن تأخير أو منع وصف دقيق للحالة الصحية. بينما استخدام الحراس يقلل من عدد الأسماك المطلوبة للكشف عن ميكروب انتشارا بين السكان، يضيف عدم حساسية الوزن باستخدام مجموعة من الأساليب، بما في ذلك الفحص البيئي5،23. الواقع حالة "محددة الممرض الحرة" تعرف عادة كعدم وجود الأنواع في المرفق مثل أنه يجب اختبار العينات البيئية والحيوانية السلبية24،25.

وتبين النتائج مسحه مستنقع التعرف على متفطره spp. التي تعتمد على الأسماك العينات قد يؤدي إلى حالة صحية سلبية كاذبة. الأنواع المتفطرات اختبار 6 الموضحة المسببة للأمراض أو المحتملة المسببة للأمراض في الزرد15 والبعض لن يتم القضاء بتطهير سطح البيض مع الكلور26 أداؤها شكل روتيني في الحجر الصحي. ولذلك، قد يكون سلبية زائفة بعض العواقب للمتعاونين الذين استيراد خطوط. على سبيل المثال، M. fortuitum ضاعت ببكر في عينات الأسماك لكن أكثر من نصف مسحه مستنقع PCR الكشف عن ذلك. وبالنظر إلى أن هذه البكتيريا أكثر مقاومة للكلور من الآخرين وقدرتهم على النمو في نظم المياه27، بل خطر لمرفق المستوردة غير الملوثة. للسماح باستيراد خطوط، المديرين بحاجة إلى ثقة ومقارنة التقارير الصحية مرفق المصدرة مع لهم. "برنامج تقييم الأداء إيكلس"28 هو المفتاح لهذه العملية في القوارض. شبكة رسمى تقارير الكشف عن جوردون م. و . م. موكوجينيكوم في الفرنسية ريريو دال-11. لا تقترح هذه البكتيريا في لوحات المختبرات التجارية التي نستخدمها. فإنه سيكون من المفيد لتمديد البرنامج إيكلس ومواءمة فحوصات التشخيص، فضلا عن قائمة الأنواع المسببة للأمراض29.

هيدروفيلا (أ) هو أيضا مسببات الأمراض التي يحتمل أن تكون أدخلت عند استيراد الحيوانات، على الرغم من قابليته للكلور30 يجعل القضاء على الأرجح أثناء تطهير سطح البيض الروتينية. مستنقع ومسحه وحماه النتائج تظهر أنه يمكن استخدام الفرز البيئي للكشف عن مسببات هذا المرض. تم اكتشاف بكتيريا أخرى مثل بكتريا spp. في الحمأة ببكر23. هذا النوع من العينة أهمية خاصة نظراً لأنها تتيح الكشف عن العوامل الممرضة تسلط. على سبيل المثال، تطبيق جديد آخر هو تحليل الحمأة لفحص الأسماك المستوردة في الحجر الصحي عين القط. الطفيلي تهديد للحيوان الصحية13 ونيوبلسا نماذج16. وعلاوة على ذلك، لا تكون تركيزات الكلور المستخدمة في تطهير سطح البيض الزرد الروتينية كفاءة31. ولذلك، يبدو أن القدرة على فحص الحيوانات المستوردة مع دوران مدته أسبوع واحد، ودون أي القتل الرحيم الأسماك جذابة جداً. هذا الأسلوب يمكن أن تؤثر قواعد الحجر الصحي والأمن البيولوجي بالسماح لفرز واردات. ثم تم تصميم عملية صنع القرار وفقا لمسببات الأمراض السائدة في المنشأة المصدرة، والكشف عن مسببات الأمراض في العينات من الأسماك المستوردة، وخطر المساس بالوضع الصحي ل مرفق المستوردة10.

التطبيقات المستقبلية أو اتجاهات بعد إتقان هذه التقنيات:

حتى إذا كان العلاج الفحص الروتيني هو الخيار الذي تم اختياره، يمكن تقييم فعالية هذا الدواء32،،من3334،35،36 مع تحليل الحمأة جهاز التكاثر. أعم من ذلك، يمكن استخدام الفرز البيئي لاختبار المركبات ضد البكتيريا والطفيليات القضاء، بما في ذلك في الأسماك [بيوتوب]. تطبيق آخر مكانة للفحص البيئي لرصد السكان الممرض في العيش آر37،38. على الرغم من أن تطبيق هذه التقنيات الرئيسية كإضافة قيمة إلى مربع أدوات التشخيص لصحة الرصد في مرافق الزرد. وبفضل الوقت والتكلفة أكثر دقة، تعريف كفاءة الحالة الصحية ومسحات مستنقع وتحليل الحمأة مكملة للمراقبة الانذارية وممارسة روتينية في الحجر الصحي. في الواقع، مستقبل هذه التقنيات لتكون جزءا روتينيا من أي تقرير الصحة المختبرات المائية.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

المؤلف يود أن يشكر فريق BRF [اقوتيكس] معهد فرانسيس كريك لمساعدتها التقنية ومدخلات حاسمة. وأيد هذا العمل المعهد فرانسيس كريك الذي يتلقى تمويله الأساسي من المملكة المتحدة "لأبحاث السرطان" (FC001999)، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (FC001999)، ومؤسسة ويلكوم ترست (FC001999).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aqua-Sed 250 mL Vetark 2-phenoxyethanol
Tubed Sterile Dryswab Tip mwe MW100 Sump surface
BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric Becton
Dickinson		 300866 They are actually
graduated to 60 ml
Centrifuge tube 15 mL Corning Corning 430766
Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing–Out Rotor (unsealed) Sanyo MSB020.CX1.5
Cover Glass 22 mm x22 mm Menzel-Glaser MNJ-350-020H
Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific F155CA Swab sediment from sludge
50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap Corning 430921
In-Tank Spawning Tray Set MBK Installations Ltd

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schroeder, P., Mocho, J. P. A veterinary perspective on laboratory zebrafish welfare. Fish Veterinary Journal. 14, 37-46 (2014).
  2. Mason, T., et al. Strategies to Mitigate a Mycobacterium marinum Outbreak in a Zebrafish Research Facility. Zebrafish. 13, Suppl 1. 77-87 (2016).
  3. Barton, C. L., Johnson, E. W., Tanguay, R. L. Facility Design and Health Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory. Zebrafish. 13, Suppl 1. 39-43 (2016).
  4. Borges, A. C., et al. Implementation of a Zebrafish Health Program in a Research Facility: A 4-Year Retrospective Study. Zebrafish. 13, Suppl 1. 115-126 (2016).
  5. Collymore, C., Crim, M. J., Lieggi, C. Recommendations for Health Monitoring and Reporting for Zebrafish Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 138-148 (2016).
  6. Geisler, R., Borel, N., Ferg, M., Maier, J. V., Strähle, U. Maintenance of Zebrafish Lines at the European Zebrafish Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 19-23 (2016).
  7. Liu, L., Pan, L., Li, K., Zhang, Y., Zhu, Z., Sun, Y. Zebrafish Health Conditions in the China Zebrafish Resource Center and 20 Major Chinese Zebrafish Laboratories. Zebrafish. 13, Suppl 1. 8-18 (2016).
  8. Martins, S., Monteiro, J. F., Vito, M., Weintraub, D., Almeida, J., Certal, A. C. Toward an Integrated Zebrafish Health Management Program Supporting Cancer and Neuroscience Research. Zebrafish. 13, Suppl 1. 47-55 (2016).
  9. Mocho, J. -P. Three-Dimensional Screen: A Comprehensive Approach to the Health Monitoring of Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 132-137 (2016).
  10. Murray, K. N., Varga, Z. M., Kent, M. L. Biosecurity and Health Monitoring at the Zebrafish International Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 30-38 (2016).
  11. Legendre, L., et al. RESAMA: A Network for Monitoring Health and Husbandry Practices in Aquatic Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 56-65 (2016).
  12. Whipps, C. M., Matthews, J. L., Kent, M. L. Distribution and genetic characterization of Mycobacterium chelonae in laboratory zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 82 (1), 45-54 (2008).
  13. Murray, K. N., Peterson, T. S. Pathology in practice. P. tomentosa infection in zebrafish. J Am Vet Med Assoc. 246 (2), 201-203 (2015).
  14. Foreyt, W. J. Veterinary Parasitology Reference Manual. , 5th Edition, Wiley-Blackwell. Ames, IA. (2001).
  15. Whipps, C. M., Lieggi, C., Wagner, R. Mycobacteriosis in zebrafish colonies. ILAR J. 53 (2), 95-105 (2012).
  16. Kent, M. L., Bishop-Stewart, J. K., Matthews, J. L., Spitsbergen, J. M. Pseudocapillaria tomentosa, a nematode pathogen, and associated neoplasms of zebrafish (Danio rerio) kept in research colonies. Comp Med. 52 (4), 354-358 (2002).
  17. Moravec, F. Observations on the bionomy of the nematode Pseudocapillaria brevispicula (Linstow, 1873). Folia Parasitol. 30, 229-241 (1983).
  18. Ramsay, J. M., Watral, V., Schreck, C. B., Kent, M. L. Pseudoloma neurophilia infections in zebrafish Danio rerio: effects of stress on survival, growth, and reproduction. Dis Aquat Organ. 88 (1), 69-84 (2009).
  19. Watral, V., Kent, M. L. Pathogenesis of Mycobacterium spp. in zebrafish (Danio rerio) from research facilities. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 145, 55-60 (2007).
  20. Whipps, C. M., Dougan, S. T., Kent, M. L. Mycobacterium haemophilum infections of zebrafish (Danio rerio) in research facilities. FEMS Microbiol Lett. 270, 21-26 (2007).
  21. Chow, F. W., Xue, L., Kent, M. L. Retrospective study of the prevalence of Pseudoloma neurophilia shows male sex bias in zebrafish Danio rerio (Hamilton-Buchanan). J Fish Dis. 39 (3), 367-370 (2016).
  22. Murray, K. N., Bauer, J., Tallen, A., Matthews, J. L., Westerfield, M., Varga, Z. M. Characterization and management of asymptomatic Mycobacterium infections at the Zebrafish International Resource Center. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 675-679 (2011).
  23. Crim, M. J., Lawrence, C., Livingston, R. S., Rakitin, A., Hurley, S. J., Riley, L. K. Comparison of Antemortem and Environmental Samples for Zebrafish Health Monitoring and Quarantine. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2017).
  24. Jensen, E. S., Allen, K. P., Henderson, K. S., Szabo, A., Thulin, J. D. PCR testing of a ventilated caging system to detect murine fur mites. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (1), 28-33 (2013).
  25. Commission Regulation (EC) No 1168/2006 of 31 July 2006 implementing Regulation (EC) No 2160/2003 as regards a Community target for the reduction of the prevalence of certain salmonella serotypes in laying hens of Gallus gallus and amending Regulation (EC) No 1003/2005 (Text with EEA relevance). OJ. L. 211, 4-8 (2006).
  26. Chang, C. T., Colicino, E. G., DiPaola, E. J., Al-Hasnawi, H. J., Whipps, C. M. Evaluating the effectiveness of common disinfectants at preventing the propagation of Mycobacterium spp. isolated from zebrafish. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 45-50 (2015).
  27. Le Dantec, C., Duguet, J. P., Montiel, A., Dumoutier, N., Dubrou, S., Vincent, V. Chlorine disinfection of atypical mycobacteria isolated from a water distribution system. Appl Environ Microbiol. 68 (3), 1025-1032 (2002).
  28. Goto, K., Hayashimoto, N., Ishida, T., Takakura, A., Kagiyama, N. First trial in the developmental phase of the "performance evaluation program" based on the ICLAS animal quality network program: self-assessment of microbiological monitoring methods using test samples supplied by ICLAS. Exp Anim. 58 (1), 47-52 (2009).
  29. Nogueira, C. L., et al. Mycobacterium saopaulense sp. nov., a rapidly growing mycobacterium closely related to members of the Mycobacterium chelonae--Mycobacterium abscessus group. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (12), 4403-4409 (2015).
  30. Massa, S., Armuzzi, R., Tosques, M., Canganella, F., Trovatelli, L. D. Note: susceptibility to chlorine of Aeromonas hydrophila strains. J Appl Microbiol. 86 (1), 168-173 (1999).
  31. Martins, M. L., Watral, V., Rodrigues-Soares, J. P., Kent, M. L. A method for collecting eggs of Pseudocapillaria tomentosa (Nematoda: Capillariidae) from zebrafish Danio rerio and efficacy of heat and chlorine for killing the nematode's eggs. J Fish Dis. 40 (2), 169-182 (2017).
  32. Maley, D., Laird, A. S., Rinkwitz, S., Becker, T. S. A simple and efficient protocol for the treatment of zebrafish colonies infected with parasitic nematodes. Zebrafish. 10 (3), 447-450 (2013).
  33. Samaee, S. M. Experimental Assessment of the Efficacy of Five Veterinary Broad-Spectrum Anthelmintics to Control the Intestinal Capillariasis in Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 12 (3), 255-267 (2015).
  34. Collymore, C., et al. Tolerance and Efficacy of Emamectin Benzoate and Ivermectin for the Treatment of Pseudocapillaria tomentosa in Laboratory Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 11 (5), 490-497 (2014).
  35. Chang, C. T., Whipps, C. M. Activity of Antibiotics against Mycobacterium Species Commonly Found in Laboratory Zebrafish. Journal of Aquatic Animal Health. 27 (2), 88-95 (2015).
  36. Chang, C. T., Doerr, K. M., Whipps, C. M. Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis: tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin. J Fish Dis. , (2017).
  37. Peterson, T. S., Ferguson, J. A., Watral, V. G., Mutoji, K. N., Ennis, D. G., Kent, M. L. Paramecium caudatum enhances transmission and infectivity of Mycobacterium marinum and M. chelonae in zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 106 (3), 229-239 (2013).
  38. Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 72-76 (2016).

Tags

علم الأحياء المجهرية، العدد 130، الفرز البيئي، هيدروفيلا Aeromonas، متفطره spp.، القط بسيودوكابيلاريا، الزرد، دانيو rerio، المراقبة، بيوفيلم، الحمأة، الحجر الصحي، والأسماك، والمياه الصحية علم الأحياء الدقيقة
الفرز البيئي <em>هيدروفيلا Aeromonas</em>و <em>بكتريا</em> spp. و <em>القط بسيودوكابيلاريا</em> في "نظم الزرد"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mocho, J. P., Martin, D. J.,… More

Mocho, J. P., Martin, D. J., Millington, M. E., Saavedra Torres, Y. Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems. J. Vis. Exp. (130), e55306, doi:10.3791/55306 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter