यहां प्रस्तुत किया गया है उच्च-संकल्प के समय-अंतराल के समय-अंतराल के इमेजिंग के लिए एक साधारण तकनीक है जो उच्च संख्यात्मक-एपर्चर के उद्देश्यों और प्रतिफल माध्यम के रूप में प्रतिफ्लोरोएडैलेन का उपयोग करके 3 दिनों तक रूट और हाइपोकॉटीयल विकास के लिए है।
पौधों के विकास के कई पहलू, जैसे कि पार्श्व रूट मोर्फोजिनेसिस, कई दिनों के समय काल में होते हैं। अंतर्निहित सेलुलर और सबसेल्युलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, उच्च संकल्प समय-व्यतीत माइक्रोस्कोपी रणनीतियों, जो शारीरिक स्थितियों को संरक्षित करते हैं, आवश्यक हैं। पौधे के ऊतकों में निरंतर गैसीय एक्सचेंज के साथ पर्याप्त पोषक तत्व और पानी की आपूर्ति होनी चाहिए, लेकिन, जब डूबे हुए और एक कंसलिप के नीचे स्थिर हो, तो वे अनॉक्सिया के लिए विशेष रूप से अतिसंवेदनशील होते हैं। सफलतापूर्वक काम करने वाली एक रणनीति ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की लगातार आपूर्ति को बनाए रखने के लिए एक छिड़काव प्रणाली का उपयोग है। हालांकि, ऐसी व्यवस्था जटिल हो सकती है, बोझिल होती है, और विशेष उपकरण की आवश्यकता होती है। यहाँ प्रस्तुत एक विसर्जन माध्यम के रूप में प्रतिफ्लोरोडास्केलिन का उपयोग कर एक सरल इमेजिंग सिस्टम के लिए एक वैकल्पिक रणनीति है। इस प्रणाली को स्थापित करना आसान है, कम से कम उपकरण की आवश्यकता होती है, और आसानी से एक माइक्रोस्कोप मंच पर माउंट किया जाता है, जिससे कई इमेजिंग कक्षों की स्थापना की जाती है और समान रूप से चित्रित किया जाता है।allel। इस प्रणाली में, बाद के रूट विकास दर पहले दो दिनों के लिए अगर प्लेटों पर मानक शर्तों के तहत विकास दर से अप्रभेद्य होते हैं, और कम से कम एक और दिन के लिए पार्श्व की दर कम हो जाती है। प्लांट के ऊतकों को एक अगर स्लैब के माध्यम से पोषक तत्वों के साथ आपूर्ति की जाती है जो कि औषधीय यौगिकों की एक श्रृंखला को संचालित करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। सिस्टम की स्थापना रूटल रूट डेवलपमेंट पर नजर रखने के लिए की गई थी, लेकिन छवि को अन्य पौध अंगों जैसे हाइपोकोटील और प्राथमिक जड़ों के लिए आसानी से अनुकूलनीय है।
पौधे के विकास के अधीन सेलुलर और सबसेल्युलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, उच्च-रिज़ॉल्यूशन दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग रणनीतियों की बढ़ती मांग है। इस तरह के इमेजिंग प्रयोगों में एक महत्वपूर्ण चुनौती शारीरिक स्थिति का रखरखाव है जिसमें पर्याप्त गैसीय आदान-प्रदान, पानी और पोषक तत्व 1 , 2 , 3 की आपूर्ति शामिल है। इष्टतम ऑप्टिकल रिज्यूशन के लिए उच्च संख्यात्मक एपर्चरों के साथ उद्देश्यों का उपयोग करने के लिए, नमूने कंसलिप के निकट के निकट और उन्मुख समानांतर में स्थित होने चाहिए। इमेजिंग के दौरान एक्स, वाई, और जेड दिशाओं में आंदोलन कम से कम होना चाहिए।
जबकि अक्सर छोटी या छोटी अवधि के इमेजिंग के लिए जल या जलीय घोल में रोपाई की जाती है, पानी में सीओ 2 और ओ 2 (1.54 मिलीग्राम / एमएल और 0.04 मिलीग्राम / एमएल, क्रमशः 20 डिग्री सेल्सियस, 0.1 एमपीए) भंग करने के लिए कम क्षमता है 4 , किसने बनायायह विस्तारित समय चूक प्रयोगों के लिए अनुपयुक्त है। छिड़काव प्रणाली जो ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के निरंतर स्तर को बनाए रखती है, इस समस्या का एक समाधान है और दोनों confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) 1 , 2 , 3 और प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी (एलएसएम) 5 के लिए विकसित किया गया है। रूट कैप 2 और रूट ऐरे 3 जैसी सिस्टम विशेष रूप से विकासशील जड़ों की समय चूक इमेजिंग के लिए तैयार किए गए हैं और कस्टम-बिल्ड बहु-नमूना डिवाइस में बीज अंकुरित करना शामिल हैं। ये व्यवस्था कम से कम यांत्रिक उलझन सुनिश्चित करती है और कई पौधों के समानांतर विश्लेषण के लिए तैयार की जाती हैं, लेकिन subcellular संरचनाओं के इमेजिंग के लिए अनुकूलित नहीं हैं। काल्डर और सहकर्मियों ने एक अधिक जटिल छिड़काव-आधारित इमेजिंग चैम्बर तैयार किया है जो सबसेल्युलर संरचनाओं के इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया गया है जिसमें नमूना एक जाल द्वारा स्थिति में आयोजित किया जाता हैउच्च बढ़ाई विसर्जन लेंस 1 के उपयोग की अनुमति देने के लिए
यहाँ प्रस्तुत एक समस्या है, जो इस समस्या का सरल समाधान है जो छिड़काव प्रणालियों पर आधारित नहीं है, लेकिन पेरफ्लोरोएडेलिन (पीएफडी) का उपयोग करता है, जो एक पेफ्लुओरकार्बन है जो हालिया में अरबीडॉप्सिस इमेजिंग 6 , 7 , 8 के लिए बढ़ते माध्यम के रूप में लोकप्रियता प्राप्त की है। इस तरह के अनुप्रयोगों में पीएफडी की उच्च क्षमता सीओ 2 और ओ 2 (1. 9 जी / एमएल पीएफडी में पीएफडी में 0.04 मिलीग्राम / एमएल पानी की तुलना में) भंग करने के लिए 9 , विसर्जित ऊतक द्वारा गैसीय विनिमय की अनुमति देता है। इसके अलावा, पीएफडी गैर फ्लोरोसेंट है और इसका अपवर्तक सूचकांक (1.313) पानी (1.333) के साथ तुलनीय है और हवा (1.000) 6 की तुलना में साइटोसोल (~ 1.4) के करीब है। विभिन्न प्रकार के पौधों और पौधों के पौधों पर पेफ्लुओरकार्बन के कम शारीरिक प्रभाव पड़ता हैपीएफडी में डूबने और पानी के 10 के साथ आपूर्ति की कम से कम दो दिनों के लिए सामान्य विकास और विकास का प्रदर्शन करते समय मूली के बीज अंकुरित होने पर अंक 6 अरबीडोपिस बीज 6 अंकुरण के लिए इसी तरह के अवलोकन किए गए हैं। घुसपैठ के बाद अरबीडोपिस के पत्ते के ऊतकों में पीएफडी के वितरण को प्रत्यक्ष रूप से चित्रित करने के लिए उत्तेजित रमन बिखरने के आधार पर, लिटिलजोन और उनके सहयोगियों ने निष्कर्ष निकाला कि पीएफडी जीवित कोशिकाओं 8 द्वारा संभवतः नहीं उठाया जाता है। पीएफडी को पहले से मुख्य रूप से इमेजियल टिश्यू में इस्तेमाल किया गया है, जहां यह इमेजिंग गहराई को बढ़ाता है क्योंकि यह कम सतह तनाव 6 के कारण आसानी से हवा में घुसपैठ कर सकता है। यहां, पीएफडी को दीर्घकालिक जड़ों के विकास के दीर्घकालिक इन्फोकल इमेजिंग के लिए अपनाया गया है। इस विन्यास में, एक या एक से अधिक पौधों को वृक्षारोपण माध्यम के एक स्लैब पर रखा जाता है जो पीएफ़डी में विसर्जित होता है। पीएफडी जी की अनुमति देता हैइमेजिंग चैम्बर में अस्तिष्क विनिमय, अनॉक्सिआ को रोकने पीएफडी अत्यधिक अस्थिर है, इसलिए इसे पॉली (डाईमेथिलसिलोक्सैन) गम की गैसकेट द्वारा बनाए रखा जाता है जिसमें उच्च गैस पारगम्यता भी होती है (1.5 x 10-12 pmol m -1 s -1 1 -1 -1 सीओ 2 के लिए ) पोषक तत्वों और पानी की आपूर्ति की जाती है अगर मध्यम के स्लैब द्वारा आपूर्ति की जाती है। इसी समय, इस अगर स्लैब धीरे से कवरलिप के खिलाफ जड़ को दबा देता है, इस तरह इमेजिंग चैंबर में अपनी रिश्तेदार स्थिति तय करता है और उच्च-रिज़ॉल्यूशन वाले पानी के विसर्जन लेंस का उपयोग करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, अगर स्लैब का इस्तेमाल औषधि के कई प्रकार के उपचारों के लिए किया जा सकता है, जिसमें डेक्सैमाथासोन, ऑरिज़लीन, और आइसॉक्सैबन शामिल हैं। इमेजिंग कक्षों को न्यूनतम उपकरण के उपयोग से मानक माइक्रोस्कोपी स्लाइड्स से बड़ी संख्या में इकठ्ठा किया जा सकता है। इमेजिंग कक्षों को विकसित और पार्श्व रूट विकास का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था, लेकिन वे प्राथमिक बीजों के इमेजिंग के लिए अनुकूल हैं जैसे मुख्य रूट टिप्स औरhypocotyls।
यहां प्रस्तुत विधि दो और तीन दिनों के लिए पार्श्व जड़ों के विकास के उच्च संकल्प confocal इमेजिंग के लिए एक सरल रणनीति है। 48 घंटे तक की अवधि के लिए, पार्श्व रूट विकास पर इमेजिंग सिस्टम का कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं देखा गया। 48 घंटे के बाद, औसत पार्श्व रूट विकास धीमा होना शुरू हुआ, हालांकि जड़ों की पर्याप्त उपसंबद्ध (37%) प्लेटों पर औसत रूट विकास के बराबर दर पर बढ़ती रही। इसलिए, जड़ों की पर्याप्त संख्या में इमेजिंग के माध्यम से, जिनके विकास में 48 घंटों के बाद धीमा पड़ता है, उन्हें बाहर रखा जा सकता है। इमेजिंग कक्षों के व्यवस्थित परीक्षण 72 घंटे से अधिक की अवधि के लिए नहीं किए गए थे, लेकिन यदि विस्तारित इमेजिंग अवधि वांछित हैं तो वैकल्पिक रणनीतियों की सिफारिश की जाती है। इमेजिंग कक्षों को सूक्ष्मदर्शी स्तर पर लगातार छोड़ा जा सकता है, यदि उपयुक्त पर्यावरण स्थितियां प्रदान की जाती हैं या विकास सुविधा को हटा दी जाती हैं और समय-समय पर माइक्रोस्कोप में वापस आ जाता है यह कई कक्षों को समानांतर में चित्रित करने की अनुमति देता है/ P>
यहाँ वर्णित कक्षों का एक फायदा यह है कि पार्श्व की जड़ों को उनकी स्थिति में तय किया गया है और इसे उच्च संकल्प जल विसर्जन लेंस का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है। स्थानिक स्थिरता समीक्षकों का समर्थन अगर स्लैब में उपयोग की गई एकाग्रता पर निर्भर करती है। प्रारंभ में 0.8% से 2 से 2% तक की अलग-अलग सांद्रता का परीक्षण किया गया, जिससे पता चलता है कि इस सीमा में उच्च सांद्रता अंतरिक्ष में स्थिर रूप से जड़ें थीं, लेकिन रूट विकास तेजी से धीमा हो गया और कुछ जड़ें यांत्रिक तनाव के संकेतों को प्रदर्शित करती हैं, जिनमें कम सेल विस्तार शामिल है। इसके विपरीत, इमेजिंग के दौरान जरूरी समर्थन और जड़ें एक्स, वाई, और जेड में चली गईं। इष्टतम 1.5% अगर स्लैब प्रतिकूल मैकेनिकल प्रभावों के बिना नमूना की स्थिति को ठीक करता है। इन शर्तों के तहत, पहले 30 मिनट या उससे पहले के निपटान के बाद, जड़ कई घंटे से अधिक स्थिर होते हैं, रातोंरात डाटा अधिग्रहण की अनुमति देते हैं। 4 डी डेटा के अधिग्रहण के दौरान, ज़-स्टाक रेंज आमतौर पर बी थीएक अतिरिक्त 5-10 माइक्रोन से रैकेट किया गया था लेकिन यह मुख्य रूप से z-drift या wobble के बजाय पार्श्व जड़ों के बाहर के विमान वृद्धि को समायोजित करने के लिए था। हालांकि मानक अगर एकाग्रता प्रवेश के खिलाफ कुछ प्रतिरोध प्रदान करता है, गुरुत्वाकर्षण से बढ़ती जड़ों अंततः अगर प्रवेश करेंगे। हालांकि, इमेजिंग चैंबर के एक मामूली संशोधन के माध्यम से, रूट विकास को कवरलिप के समानांतर बनाए रखा जा सकता है, जिससे पुराने पार्श्व जड़ों और प्राथमिक जड़ों को इमेज किया जा सकता है। इसके अलावा, बुनियादी इमेजिंग कक्ष को आसानी से हाइपोकॉटील के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हाइपोकोटिल्स इस प्रणाली में अधिक स्वतंत्र रूप से तैर रहे हैं ताकि छवि अधिग्रहण के लिए z- अक्ष ब्रैकेट आमतौर पर लगभग 20 माइक्रोन तक बढ़ गया। इस अध्ययन में, एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पूरे इस्तेमाल किया गया था, जिससे सब्सट्रेट के गुणों को नियंत्रित किया जा सकता था। इमेजिंग चैम्बर उलटा माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगरेशन के लिए अनुकूलनीय हो सकता है, लेकिन अंतराल करने वाले अंगों पर कठोर coverslip के समय पर निर्भर प्रभाव का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होगी। </p>
लिटिलजोन और सहकर्मियों ने यह बताया है कि पीएफडी स्वयं जैविक अणुओं को आसानी से भंग नहीं करता है, जिसका अर्थ है कि इसे औषधीय यौगिकों के वितरण के लिए प्रत्यक्ष रूप से इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। इस समस्या को समेकित विकास माध्यम के स्लैब के माध्यम से ऐसे यौगिकों की आपूर्ति करके दूर किया गया था, जिस पर अगर स्लैब टिकी हुई है हालांकि छिड़काव प्रणाली धो-आउट प्रयोगों के लिए पसंद की विधि रहेगी, जबकि इमेजिंग चैंबर डीएक्सएमेथासोन 12 और अन्य यौगिकों के प्रशासन के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है। एक नोट, जबकि यह लेख तैयारी वॉन वेगनहेम और उनके सहकर्मियों में था 18 ने हल्के शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर पार्श्व रूट विकास इमेजिंग के लिए एक कक्ष का वर्णन किया।
The authors have nothing to disclose.
हम बीज-व्यक्त आरएफपी-ट्यूबल 6 और सहायक सुधारों के लिए एक अनाम समीक्षक के लिए प्रोफेसर जेफ्री वस्तीनी, ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय का धन्यवाद करते हैं। हम प्रोफेसर ह्यू डिकिन्सन के लिए आभारी हैं कि हमें सेल्यूलोज फिल्म के उपयोग के लिए एक मैकेनिकल समर्थन और फोटोग्राफी के लिए जॉन बेकर के रूप में सतर्क करने के लिए अलर्ट किया गया। यह काम बीबीएसआरसी अनुसंधान अनुदान BB / G013993 / 1 और बीबी / डी 0 0 04055/1 को आईएम में, और बीबीएसआरसी डॉक्टरल प्रशिक्षण पुरस्कार और सीके को क्लैरेडन छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित था
Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80mm disc |