हम इस मॉडल से ट्यूमर कोशिकाओं या ऑर्गोइओड्स के चूहों के सीक्यूम में इंजेक्शन और ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) को परिचालित करने के बाद के अलगाव के माध्यम से ऑर्थोपोटीक कोलोर्टेटल ट्यूमर की स्थापना का वर्णन करते हैं।
आसान प्रयोज्यता और लागत-प्रभावशीलता के फायदे होने के बावजूद, चमड़े के नीचे के माउस मॉडल में गंभीर सीमाएं होती हैं और ट्यूमर जीव विज्ञान और ट्यूमर सेल के प्रसार को सही रूप से अनुकरण नहीं करते हैं। ऑर्थोप्ोटिक माउस मॉडल इन सीमाओं को दूर करने के लिए पेश किया गया है; हालांकि, ऐसे मॉडल तकनीकी रूप से मांग कर रहे हैं, खासकर खोखले अंगों जैसे बड़ी आंत में ट्यूमर कोशिका तैयार करने और इंजेक्शन की मानकीकृत तकनीकों के लिए महत्वपूर्ण ट्यूमर का निर्माण करने के लिए जो मज़बूती से बढ़ते हैं और मेटास्टाजइज होते हैं
हमने कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) के एक ओर्थोपोटीक माउस मॉडल विकसित किया है जो अत्यधिक वर्दी ट्यूमर विकसित करता है और ट्यूमर जीव विज्ञान के अध्ययन के साथ-साथ चिकित्सीय परीक्षणों के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। या तो प्राथमिक ट्यूमर, 2-आयामी (2 डी) सेल लाइनों या 3-आयामी (3 डी) ऑर्गोइओड्स से ट्यूमर कोशिकाओं को सीकेम में अंतःक्षिप्त किया जाता है और इंजेक्शन ट्यूमर कोशिकाओं की मेटास्टैटिक क्षमता पर निर्भर करता है, अत्यधिक मेटास्टैटिक ट्यूमर बनाती है। इसके साथ – साथ,सीटीसी नियमित रूप से पाया जा सकता है। हम यहां ट्यूमर सेल की तैयारी की तकनीक का वर्णन 2 डी सेल लाइनों और 3 डी अंगोइड्स के साथ-साथ प्राथमिक ट्यूमर के ऊतक, सर्जिकल और इंजेक्शन तकनीकों के साथ-साथ ट्यूमर-असरिंग माइस से सीटीसी की अलगाव, और समस्या निवारण के लिए वर्तमान टिप्स का वर्णन करते हैं।
कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) पश्चिमी देशों में कैंसर की मृत्यु के सबसे सामान्य कारणों में से एक है। 1 जबकि प्राथमिक ट्यूमर को अक्सर शोध किया जा सकता है, दूरस्थ मेटास्टेस की घटना नाटकीय रूप से पूर्वानुमान के कारण बिगड़ती है और अक्सर मृत्यु की ओर जाता है। 2 , 3 मेटास्टेसिस का जैविक सहसंबंध ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) को परिचालित करता है, जो ट्यूमर से अलग होता है, संचलन में जीवित रहता है, लक्ष्य अंग में एपिथेलियम को संलग्न करता है, अंग पर आक्रमण करता है और अंत में नए घावों के लिए बड़ा हो जाता है। 4 यद्यपि सीटीसी प्रजनन संबंधी प्रासंगिकता के लिए जाना जाता है, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 सीआरसी में उनकी अति दुर्लभता के परिणामस्वरूप उनके जीव विज्ञान को आंशिक रूप से समझा जाता है। 10
माउस मॉडल एक शक्तिशाली टी हैंकैंसर जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए ओओल शास्त्रीय, चमड़े के नीचे के ट्यूमर मॉडलों को प्राप्तकर्ता चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं के चमड़े के नीचे के इंजेक्शन द्वारा उत्पादित किया जाता है, जो कि या तो प्रतिरक्षी हो सकता है (यदि syngeneic murine ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है) या immunodeficient चमड़े के नीचे ट्यूमर मॉडल सस्ती हैं और डेटा का तेजी से उत्पादन करते हैं; उनके अंत-बिंदु ट्यूमर के विकास को आसानी से और गैर-इनवेसिली मापा जा सकता है। हालांकि, 88% नए यौगिकों ने इस तरह के मॉडल में एंटीट्यूमर गतिविधि का प्रदर्शन किया है, जो नैदानिक परीक्षणों में विफल होते हैं। 11 यह अंतःप्रेरणा के कारण मानव और चूहों के बीच अंतर है; हालांकि, इस विफलता का एक बड़ा हिस्सा चमड़े के नीचे माउस मॉडल के कम भविष्य कहनेवाले मूल्य के कारण है।
ऑर्थोपाइक माउस मॉडल, जिसमें ट्यूमर कोशिकाओं को मूल के अंग में अंतःक्षिप्त किया जाता है और इस प्रकार उनके मूल सूक्ष्म ऊर्जा में बढ़ता है, इसलिए कैंसर के अनुसंधान में इसका तेजी से उपयोग किया जाता है। 11 , 12 , </sअप> 13 , 14 ऑर्थोपेनिक मॉडल न केवल स्थानीय ट्यूमर के विकास की स्थिति अनुकरण करते हैं; ट्यूमर विकास की शारीरिक रूप से सही साइट के परिणामस्वरूप, ऑर्थोपीक माउस मॉडल भी मेटास्टेसिस के यथार्थवादी सिमुलेशन की अनुमति देता है और इसलिए सीटीसी जीव विज्ञान 8 , 15 , 16 या सीआरसी में विभिन्न उपचारों के प्रति उनका जवाब देने के लिए उपयोग किया जाता है। 13 , 17
ऑर्थोपाइक माउस मॉडल का एक बड़ा नुकसान उनकी तकनीकी जटिलता है। उस अंग के आधार पर जिसमें कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है, तब तक सीखने की वक्र जब तक प्रयोगकर्ता प्रजननक्षम ट्यूमर को प्रेरित करने में सक्षम नहीं होता है, तब तक यह लंबे समय तक होता है। यह विशेष रूप से कोलोरेक्टल कैंसर के मॉडल पर लागू होता है, क्योंकि ट्यूमर कोशिकाओं को आंत्र की दीवार में इंजेक्ट करने की आवश्यकता होती है, जो अक्सर छिद्र, ट्यूमर सेल रिसाव या एंडोलुमाइनल ट्यूमर सेल के नुकसान का परिणाम है। यह ऐकआरटीआईएल का लक्ष्य प्राथमिक ऊतक नमूनों, 2 डी कोशिका लाइनों और 3 डी आर्नोजेड संस्कृति से सेल तैयारी की विधि और चूहों के सिकम में उनके इंजेक्शन का वर्णन करना है। यहां वर्णित तकनीक अत्यधिक वर्दी ट्यूमर की ओर जाता है और, प्राप्तकर्ता चूहों में इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली सेल लाइन के ट्यूमर जीव विज्ञान, दूर के मेटास्टेस के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संरचना और सीटीसी के आधार पर। 15
चमड़े के नीचे के माउस मॉडल में अपने प्रीक्लिन्नीक साबित गतिविधि के बावजूद, महान उपन्यास संयुग्म नैदानिक परीक्षणों में विफल होते हैं और क्लिनिक तक कभी नहीं पहुंचते। 11 ट्यूमर के जीव विज्ञान …
The authors have nothing to disclose.
यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (हम 3548 / 4-1) और रोलाण्ड-अर्नस्ट-स्टिटंग फर गेशुन्थिट्विसेन (1/14) द्वारा समर्थित था।
Cell culture Media and Components | |||
Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical Equipment | |||
Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
Buprenorphine | Temgesic | – | |
Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CTC isolation | |||
EDTA | Roth | 8040.1 | |
Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
PAP pen | Abcam | ab2601 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunohistochemistry | |||
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |