Выделение циркулирующих опухолевых клеток в модели ортотопической мыши колоректального рака
Summary
Мы описываем установление ортотопических колоректальных опухолей путем инъекции опухолевых клеток или органоидов в слепую кишку мышей и последующее выделение циркулирующих опухолевых клеток (CTC) из этой модели.
Abstract
Несмотря на преимущества легкой применимости и экономической эффективности, подкожные мышиные модели имеют серьезные ограничения и не точно имитируют биологию опухоли и распространение опухолевых клеток. Для преодоления этих ограничений были введены модели ортотопической мыши; Однако такие модели технически требуются, особенно в полых органах, таких как толстая кишка. Для получения однородных опухолей, которые надежно растут и метастазируются, стандартизированы методы подготовки и инъекции опухолевых клеток.
Мы разработали ортотопическую модель мышиного колоректального рака (CRC), которая развивает сильно однородные опухоли и может быть использована для исследований опухолевой биологии, а также для терапевтических испытаний. Опухолевые клетки из первичных опухолей, двумерных (2D) клеточных линий или трехмерных (3D) органоидов вводятся в слепую кишку и, в зависимости от метастатического потенциала инъецированных опухолевых клеток, образуют высокометастатические опухоли. К тому же,КТК можно найти регулярно. Здесь мы описываем методику получения опухолевых клеток как с 2D клеточными линиями, так и с 3D-органоидами, а также с первичной опухолевой тканью, хирургическими и инъекционными методами, а также с отделением CTC от опухолевых мышей и представляем советы по устранению неполадок.
Introduction
Колоректальный рак (CRC) является одной из наиболее распространенных причин смерти от рака в западных странах. 1 В то время как первичная опухоль может часто быть иссекают, возникновение отдаленных метастазов значительно ухудшает прогноз и часто приводит к смерти. 2 , 3. Биологический коррелятор метастаза – это циркулирующие опухолевые клетки (CTC), которые отделяются от опухоли, выживают в обращении, прикрепляются к эпителию в органе-мишени, вторгаются в орган и в конечном итоге перерастают в новые очаги. 4 Хотя известно, что CTC имеют прогностическую значимость, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 их биология лишь частично понимается как результат их крайней редкости в CRC. 10
Модели мышей – мощные tOol для изучения различных аспектов биологии рака. Классические, подкожные опухолевые модели продуцируются путем подкожной инъекции опухолевых клеток мышам-реципиентам, которые могут быть либо иммунокомпетентными (если используются сингенные мышиные опухолевые клетки), либо иммунодефицитом. Модели подкожных опухолей являются недорогими и быстро производят данные; Их конечный рост опухоли может быть легко и неинвазивно измерен. Однако 88% новых соединений, которые продемонстрировали противоопухолевую активность в таких моделях, не проходят в клинических испытаниях. 11 Это отчасти связано с межвидовыми различиями между людьми и мышами; Однако большая часть этого отказа объясняется низким прогностическим значением подкожных моделей мыши.
Модели ортотопических мышей, в которых опухолевые клетки вводятся в орган происхождения и, таким образом, растут в их первоначальном микроокружении, поэтому все чаще используются в исследованиях рака. 11 , 12 , </sUp> 13 , 14 Ортотопические модели не только моделируют местные условия роста опухоли; В результате анатомически правильного участка роста опухоли модели ортотопической мыши также позволяют реалистичное моделирование метастазов и поэтому используются для изучения биологии 8 , 15 , 16 CTC или их реакции на различные методы лечения в CRC. 13 , 17
Основным недостатком ортотопических моделей мыши является их техническая сложность. В зависимости от органа, в который должны вставляться клетки, кривая обучения до тех пор, пока экспериментатор не сможет индуцировать воспроизводимые опухоли, довольно длительный. Это особенно относится к колоректальным раковым моделям, поскольку опухолевые клетки необходимо вводить в стенку кишечника, что часто приводит к перфорации, утечке опухолевых клеток или потере эндолюминальной опухолевой клетки. ЭтоЦелью настоящего изобретения является описание способа подготовки клеток из образцов первичной ткани, двумерных клеточных линий и трехмерной органоидной культуры и их инъекции в слепую мышь. Описанная здесь методика приводит к высокоравномерным опухолям и, в зависимости от биологии опухоли клеточной линии, используемой для инъекций, воспроизводимому образованию отдаленных метастазов и КТК у реципиентных мышей. 15
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на их доклинически доказанную активность в подкожных моделях мыши, подавляющее большинство новых соединений терпят неудачу в клинических испытаниях и никогда не попадают в клинику. 11 Эта очевидная недостаточность подкожных моделей мыши для точного моделирован?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Германским исследовательским фондом (WE 3548 / 4-1) и Роланд-Эрнст-Штифтун фюр-Гесундхицвезен (1/14).
Materials
| Cell culture Media and Components | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
| cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
| Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
| Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine | Temgesic | – | |
| Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
| Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
| Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
| Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
| EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
| HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
- Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
- Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again?. Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
- Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
- Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201 (2015).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82 (2013).
- Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484 (2007).
- Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
- Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
- Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107 (2014).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
- Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
- Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).
