Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu
Summary
Farelerin çekumuna tümör hücreleri veya organoidler enjekte edilerek ortotopik kolorektal tümörlerin oluşumunu ve ardından bu modelden dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'lerin) izole edilmesini açıklıyoruz.
Abstract
Kolay uygulanabilirlik ve maliyet etkinliğinin avantajlarına rağmen, subkutan fare modelleri ciddi sınırlamalara sahiptir ve tümör biyolojisi ve tümör hücresi yayılımını doğru bir şekilde simüle etmemektedir. Ortotopik fare modelleri bu sınırlamaların üstesinden gelmek için sunulmuştur; Bununla birlikte, bu tür modeller teknik olarak özellikle büyük bağırsak gibi içi boş organlarda talep ederler. Güvenilir bir şekilde büyüyen ve metastaz yapan tek tip tümörler üretmek için, standartlaştırılmış tümör hücresi hazırlama teknikleri ve enjeksiyon önemlidir.
Oldukça üniform bir tümör geliştiren ve tümör biyolojisi çalışmaları ve terapötik denemeler için kullanılabilen bir ortotopik fare modelinde kolorektal kanser (CRC) geliştirdik. Primer tümörler, 2 boyutlu (2D) hücre dizileri veya 3 boyutlu (3D) organoidlerden gelen tümör hücreleri çekum içine enjekte edilir ve enjekte edilen tümör hücrelerinin metastatik potansiyeline bağlı olarak oldukça metastatik tümörler oluşturur. Ek olarak,CTC'ler düzenli olarak bulunabilir. Burada, 2D hücre çizgilerinin ve 3D organoidlerin yanı sıra primer tümör dokusundan, cerrahi ve enjeksiyon tekniklerinin yanı sıra tümörlü farelerden CTC'lerin izolasyonu ve mevcut sorun giderme ipuçlarından tümör hücresi hazırlama tekniğini açıklıyoruz.
Introduction
Kolorektal kanser (CRC), batı ülkelerinde kanser ölümünün en yaygın nedenlerinden biridir. Primer tümör genellikle rezeke edilebilir olsa 1, uzak metastaz oluşumu önemli ölçüde ölüme götürecek sıklıkla prognozu kötüleştirir ve. 2 , 3 Metastazın biyolojik korelasyonu, tümörden ayrılan dolaşımdaki tümör hücreleridir (CTC'ler), dolaşımda hayatta kalır, hedef organdaki epitele bağlanır, organı istila eder ve nihayetinde yeni lezyonlara doğru büyür. Dolaşımda bulunan tümör hücreleri prognostik alaka, 5, 6, 7, 8, olduğu bilinmektedir, ancak 4, 9 biyoloji kısmen CRC bunların çok nadir bir sonucu olarak anlaşılmaktadır. 10
Fare modelleri güçlü bir tOol kanser biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek. Klasik, subkütan tümör modelleri, alıcı camlara tümör hücrelerinin subkütan enjeksiyonuyla üretilir; bu, bağışıklık kazandıran (eş merkezli tümör hücreleri kullanılıyorsa) veya immün yetmezlik gösterebilir. Subkütan tümör modelleri ucuzdur ve verileri hızlı bir şekilde üretir; Uç nokta tümör büyümesi kolaylıkla ve invaziv olarak ölçülebilir. Bununla birlikte, bu tür modellerde antitümör aktivite sergileyen yeni bileşiklerin% 88'i klinik araştırmalarda başarısız olur. 11 Bu kısmen insanlarla fare arasındaki farklılıklar nedeniyle; Bununla birlikte, bu başarısızlığın büyük bir kısmı subkutan fare modellerinin düşük prediktif değerinden kaynaklanmaktadır.
Tümör hücrelerinin orijin organına enjekte edildiği ve böylece orijinal mikro ortamda büyüdüğü ortotopik fare modelleri, kanser araştırmalarında giderek daha fazla kullanılır. 11 , 12 , </sUp> 13 , 14 Ortotopik modeller sadece lokal tümör büyüme koşullarını simüle etmekle kalmaz; Ortotopik fare modelleri, tümör büyümesinin anatomik olarak doğru bir yerinin bir sonucu olarak, metastazın gerçekçi simülasyonunu sağlar ve bu nedenle CRC'deki farklı tedavilere 8 , 15 , 16 veya CTC biyolojisini incelemek için kullanılır. 13 , 17
Ortotopik fare modellerinin en büyük dezavantajı, teknik karmaşıklığıdır. Hücrelerin enjekte edileceği organa bağlı olarak, deneyci, tekrarlanabilir tümörleri indükleyene kadar öğrenme eğrisinin oldukça uzundur. Bu, özellikle tümör hücrelerinin bağırsak duvarına enjekte edilmesi gerektiği için kolorektal kanser modelleri için geçerlidir, bu genellikle perforasyon, tümör hücresi sızıntısı veya endoluminal tümör hücre kaybına neden olur. Bu birBu makale, birincil doku numunelerinden, 2D hücre çizgilerinden ve 3D organoid kültüründen hücre hazırlama yöntemini ve bunların farelerin çekumuna enjekte edilmesini amaçlamaktadır. Burada tarif edilen teknik, enjeksiyon için kullanılan hücre hattının tümör biyolojisine bağlı olarak, alıcı farelerde uzak metastazların ve CTC'lerin tekrarlanabilir formasyonuna yol açarak, oldukça tekdüze tümörlere yol açar. 15
Protocol
Representative Results
Discussion
Deri altındaki fare modellerinde klinik olarak kanıtlanmış etkinliklerine rağmen yeni bileşiklerin büyük çoğunluğu klinik araştırmalarda başarısız olur ve kliniğe asla ulaşmazlar. 11, deri altı fare modellerinde bu bariz yetmezliği doğru tümörlerin biyoloji ve büyüme kalıpları doğrudan orijinal organ, tümör hücrelerinin enjeksiyonundan göre ortotopik fare modellerinin geliştirilmesine yol açmıştır simüle edilmiştir.
Ortotopik far…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (We 3548 / 4-1) ve Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Cell culture Media and Components | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
| cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
| Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
| Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine | Temgesic | – | |
| Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
| Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
| Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
| Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
| EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
| HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
- Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
- Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again?. Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
- Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
- Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201 (2015).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82 (2013).
- Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484 (2007).
- Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
- Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
- Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107 (2014).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
- Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
- Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).
