초음파 유도 Intracardiac 주입 실험 선 동적인 장 질병의 Murine 모델에 사용 하기 위해 내장을 추적 증가 인간 중간 엽 줄기 세포의
Summary
장 염증의 모델에서 murine 연구 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 작은 비율 (1 ~ 5%) 또는 정 맥 주입 intraperitoneally 집 염증이 콜론과1,2에 설명 했다. 이 연구는 MSCs의 초음파 유도 intracardiac 주사 소장을 증가 지역화 될 보여줍니다.
Abstract
Crohn의 질병 (CD) 작은의 일반적인 만성 염증 성 질환 이며 큰 창 자. Murine와 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 면역 잠재력 있고 비록 관리의 그들의 추적 및 효과 1 를 제한할 수 있습니다 마우스 모델 장 염증, 염증 억제를 보였다 , 3 , 4 , 5. 저 승 부상 모델 MSCs의 로컬 응용 프로그램 장황 결에 염증에 큰 효능을 보이고 있다. 그러나, 인간 골 수 유래 MSCs (hMSCs) 소장, SAMP-1/YitFc (SAMP) 모델 실험 Crohn의 질병의 염증의 사이트에의 현지화를 강화 하는 기술에 대 한 데이터의 부족이입니다. 이 작품 hMSCs SAMP 쥐에 만성 장 염증의 특징이 잘 자발적인 모델의 초음파 유도 intracardiac 주입에 대 한 새로운 기술을 설명합니다. 성별 및 나이-일치, 염증 없는 AKR/J (AKR) 마우스 컨트롤으로 사용 되었다. biodistribution와 지역화를 분석 하려면 hMSCs lentivirus 트리플 기자 포함으로 불리고 있었다. 트리플 기자 발광 영상; 대 한 반딧불 luciferase (fl)의 구성 단위체 빨간 형광 성 단백질 (mrfp), 셀 정렬; 그리고 잘린된 포진 심 플렉스 바이러스 티 미 딘 키 니 아 제 (ttk), 양전자 방출 단층 촬영 (애완 동물)에 대 한 이미징. 이 연구의 결과 hMSCs 염증 무료 AKR 마우스 반대 SAMP 쥐의 소장에 지역화 intracardiac 관리 후 그 24 시간을 보여줍니다. 이 소설, SAMP 쥐의 좌 심 실에서 hMSCs의 주입 초음파 유도 세포 배달, 최소한의 병 적 상태와 사망률 쥐의 급속 한 회복에 대 한 수의 높은 성공률을 보장 합니다. 이 기술은 TNFΔRE6등 작은 창 자 염증의 다른 모델에서 MSCs의 향상 된 지역화에 대 한 유용한 방법을 수 있습니다. 미래 연구는 간 동맥 배달에 의해 hMSCs의 증가 지역화 증가 치료 효능으로 이어질 수 있습니다 경우 결정 됩니다.
Introduction
Crohn의 질병 (CD) 작은의 일반적인 만성 염증 성 질환 이며 대형 창 고 장내 미생물7,8호스트 면역 시스템의 부적 절 한 응답 결과로 생각 된다. 최근 연구 murine와 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 창 자 염증1,3,,45의 마우스 모델에서 염증 억제 수 있습니다 나타났습니다. 선 동적인 장 질병 (IBD), CD9를 포함 하는 환자를 치료 하 골 또는 지방이 많은 직물에서 파생 된 인간의 MSCs를 사용 하는 여러 지속적인 임상 시험이 있다. MSC 치료에 대 한 두 개의 노선이 임상 시험에 사용 되었습니다: 하나 체계적 주입을 포함 한다 (즉, 정 맥) luminal IBD (CD 포함), 및 다른 MSCs의 지역화 된 응용 프로그램/는 누 관에 줄기 세포의 주입을 포함 한다. 항문 주위의 CD 환자의 요 로입니다. 최근 메타-분석에서 MSC IBD, 조직에 대 한 치료의 (즉, 정 맥) MSC luminal IBD (CD 포함)에 대 한 치료는 최대 40%에 효능 (95 %CI: 7-79%)의 환자, 효능은 61%에 훨씬 더 높은 반면 (95 %CI: 36-85%) 때 MSCs 병에 걸린 CD 누9에 로컬로 주입 했다. 최근 단계 III multicenter 무작위 위약 제어 재판 음부 fistulae, 치유의 통계적으로 중요 한 임상 및 방사선 증거를 보여주었다 CD 환자의 항문 주위 누 관에 직접 주입 하는 수용자 지방 줄기 세포의 10메타 분석 결과 확실 한지 알아보는. MSC 치료 정 맥 luminal CD에 대 한 주어진 낮은 효능에 대 한 이유는 부적당 하 게 조사 되었습니다, 하지만 이유 중 하나는 염증의 사이트에 MSCs의 불 충 분 한 수단은 될 수 있습니다. 장 염증의 모델에서 murine 연구만 MSCs (1-5%) 정 맥 주입의 작은 비율 도달 염증이 콜론과; 나머지 MSCs는 폐 (1 차 통과 효과)1,2에 의해 필터링 됩니다 증명 ,5,,1112. 여러 murine 연구 결과 따라서 MSC 관리4대 장 염 동물 모델에서 복 경로 (i.p.) 사용. 그러나, 그들은 또한 그만 셀의 극히 일부에 도달 하 고 콜론을 engraft와 효능은 관련이 녹는 paracrine 요인, 종양 괴 사 인자를 유도할 수 있는 유전자 6 단백질의 분 비 (TSG-6)2시연 했습니다. 면역 억제와 치유의 MSC 메커니즘 포함 paracrine;를 포함 하는 multipronged 접근 셀 근접에 독립적인 요인, TSG-6; 근접-종속 요소를 같은 세포 죽음-ligand (PD-L1); 1 프로그램 또는 가변 1입니다. 따라서, 염증의 사이트에 MSC 지역화 증가 효능9,13발생할 수 있습니다. 사실, 최근 연구는 저 승 상해의 사이트에 직접 이식 하는 MSCs 결과 신생 촉진 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)를 은닉 하 여 치유에 나타났다. 다른 한편으로, 최소한의 치료 효과 주사5후 지적 했다. (즉, SAMP 쥐에서 소장) 염증의 사이트에 그들의 지 방화를 증가, 좌 심 실에 MSC 관리용이 intracardiac 주입 초음파 기반 기술 개발 되었습니다. 이미지 유도 주입 정확한 주입, 성공의 더 높은 속도로 리드 하 고 병 적 상태와 사망률 감소를 보장 합니다. 또한, 좌 심 실에 MSCs 주입 동맥 순환, 폐에서 덫을 놓아 되기 전에 염증이 소장 도달할 수 어디에 그들을 제공 합니다.
이 연구에서는 인간의 골 수 파생 된 MSCs (hMSCs) CD14SAMP-1/YitFc (SAMP) murine 모델에 주입을 위해 사용 되었다. SAMP 개발 거의 100% penetrance14작은 창 자 염증 만성 염증의 특징이 잘 자발적인 murine 모델 이다. 염증은 microflora 화학, 면역, 또는 유전 조작의 부재에서에 대 한 응답에서 개발 하 고 밀접 하 게 인간의 CD11. 성별 및 나이 일치 염증 무료 AKR/J (AKR) 쥐, SAMP, 보호자 제어 쥐가이 연구에 사용 되었다.
HMSCs는 고립 되었고 후 동의 사용 하 여 유효성을 검사 하 고 이전 프로토콜15,16게시 일반, 미확인 기증자 로부터 얻은 골 수 (BM) 샘플에서 실험실에서 확장. 격리 및 확장, MSC 능력 후에 osteogenic, adipogenic, chondrogenic 차별화는 여러 분석15실험실에서 평가 했다. Osteogenic 기능 분석 결과 피하 immunocompromised CB17-Prkdc SCID 쥐17에 hMSCs를 포함 하는 hydroxyapatite/tricalcium 인산 행렬의 세라믹 큐브를 이식 하 여 수행 되었다. 큐브 분석 결과 골 및 잠재적인 chondrogenesis 및 고 개별 MSC 준비17를 평가 하기 위한 궁극적인 시험으로 간주 됩니다. 주입 후 hMSCs에서 vivo에서 시각화 하기 lentivirus transduce 반딧불 luciferase (플로리다), 단위체 빨간 형광 성 단백질 (mRFP), 그리고 포진 심 플렉스 바이러스 성 티 미 딘 키 니 아 제 (ttk의 구성 된 트리플 리포터 유전자 구조와 hMSCs를 사용 되었다 ), 수정된 myeloproliferative 육 종 바이러스 (국방부) 발기인18에 의해 구동. 트리플 기자에 반딧불 luciferase 효소 hMSCs에서 oxyluciferin로 변환 하 여 주입된 소 그 고 광자/화이트 빛을 생성 한다. 이는 vivo에서 광학 이미징 시스템, 마우스에서 라이브 hMSCs의 시각화를 사용에 민감한 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라 (생물 발광)에 의해 감지 됩니다. 생물 발광 영상 (BLI)는 셀을 추적 및 분석 비보 전 직렬로 사용 될 수 있는 중요 한 기술입니다. 강력한 국방부 발기인의 사용 트리플 퓨전 기자 유전자 구성의 연속 식 구동 하 고 16 주19이상 주입 된 hMSCs의 이미징에 대 한 수 있습니다. hMSCs는 transduce 고 낮은 변환 효율성에 어렵다. 최적화 된 프로토콜을 사용 하 여, hMSCs 변환 효율 향상 되었다 고 transgene 식 향상 된18살. Cytometry에 mRFP 식 (트리플 리포터 유전자 중 하나)를 사용 하 여, 최대 83%의 높은 효율으로 hMSCs transduce 능력 시연 했다. 차별화 분석 실험 및 큐브 분석 vivo에서 chondrocytes, adipocytes, 및 osteocytes17로 분화 transduced hMSCs의 능력을 설명 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 hMSCs 실험 CD의 작은 장 마우스 모델에서의 초음파 유도 intracardiac 주입에 대 한 소설 기법을 설명합니다. 이 기술은 매우 높은 비율의 생존과 성공, 바늘의 궤적을 마우스 좌 심 실, 초음파에 의해 제공의 실시간, 고해상도 이미지에 따라 조정 될 수 있다 있다. 좌 심 실에 배달의 장점은 hMSCs intra-arterially 배포 다음 하 고 우회 정 맥 순환, 폐에 있는 셀의 집계를 피할. 이전에 간 동맥 배달?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maneesh 데이브는 국방부의 그랜트 PR141774와 크 론 및 Colitis 재단의 미국 경력 개발 수상에 의해 지원 됩니다. 파비오 Cominelli 연구실 NIH에 의해 지원 됩니다 DK042191 (F.C.), DK055812 (F.C.), DK091222 (F.C.) 및 DK07948 (F.C.) 부여. 아놀드 캐 플 란의 실험실 L. 데이비드 E. 버지니아 볼드윈 재단에 의해 부분에서 지원 됩니다. 자금 지원 기관 연구 분석 또는 원고 쓰기에 아무 역할을 했다. 그 내용을 전적으로 저자의 책임입니다.
Materials
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) | ||
References
- Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
- Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
- Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
- Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
- Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn’s disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
- English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
- Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn’s disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
- Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
- Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
- Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
- Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
- Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
- Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
- Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
- Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
- Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
- Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
