Kontrollerbar Ion Channel Expression gennem Inducible Transient transfektion

Summary

Studere ionkanaler gennem et heterologt udtrykker system er blevet en central teknik i biomedicinsk forskning. I dette manuskript, præsenterer vi en tid effektiv metode til at opnå tæt kontrolleret ionkanal-ekspression ved at udføre transient transfektion under kontrol af en inducerbar promotor.

Abstract

Transfektion levering af fremmede nukleinsyrer i en celle, er et effektivt værktøj i protein forskning. Gennem denne metode, kan ionkanaler undersøges gennem elektrofysiologisk analyse, biokemisk karakterisering, mutationsmønstre undersøgelser, og deres virkninger på cellulære processer. Transiente transfektioner tilbyder en enkel protokol, hvor proteinet bliver tilgængelig for analyse i løbet af få timer til dage. Selv om denne fremgangsmåde giver en forholdsvis enkel og tidsbesparende protokol, er en af ​​de kritiske komponenter kalibrering ekspressionen af ​​genet af interesse til fysiologiske relevante niveauer eller niveauer, der er egnet til analyse. Til dette formål har mange forskellige tilgange, der tilbyder muligheden for at styre ekspressionen af ​​genet af interesse opstået. Adskillige stabile celle transfektionsprotokoller giver en måde at permanent indføre et gen af ​​interesse i det cellulære genom under regulering af et tetracyclin-kontrolleret transcriptional aktivering. Mens denne teknik producerer pålidelige ekspressionsniveauerne, hvert gen af ​​interesse kræver et par ugers faglært arbejde, herunder kalibrering af en dræbende kurve, udvælgelse af celle kolonier, og generelt flere ressourcer. Her præsenterer vi en protokol, som anvender transient transfektion af Transient Receptor Potential kationkanal underfamilien V element 1 (TRPV1) gen i et inducerbart system, som en effektiv måde til at udtrykke et protein i en kontrolleret måde, som er væsentlig i ionkanal analyse. Vi viser, at bruge denne teknik, er vi i stand til at udføre calcium imaging, hel celle, og en enkelt kanal analyse med kontrollerede kanalniveauer kræves for hver enkelt af indsamling af data med en enkelt transfektion. Samlet giver dette en replikerbar teknik, der kan anvendes til at studere ionkanaler struktur og funktion.

Introduction

Heterologt udtrykker systemer er en af de mest udbredte teknikker til at studere en mangfoldighed af cellulære funktioner ^1. Deres lave endogent protein profil, minimal vedligeholdelse, pålidelig vækst, og evne til at optage og udtrykke fremmed DNA har gjort cellelinjer, såsom humane embryonale Kidney (HEK293) og kinesisk hamster ovarie (CHO) næsten afgørende for biologisk forskning ^{2, 3.} Forskningsområder hjælp heterologe systemer omfatter membranproteiner, intracellulær signalering og enzymatisk aktivitet. Efter transfektion af fremmed DNA ind i cellen, kan udføres mange forskellige former for analyse, herunder elektrofysiologi, ratiometrisk calcium imaging, western blot, etc. ^{4, 5.}

På grund af den brede vifte af mulige anvendelser for heterologe ekspressionssystemer, mange Forskelnt reagenser og produkter er blevet udviklet til at udnytte disse celler og deres kvaliteter ^6. DNA afgivelsessystemer, der transient eller permanent integrere fremmed DNA i celler for at studere exogent protein er blevet en af ​​de mest populære og nyttige værktøjer til biologisk forskning. Mere specifikt er transient transfektion af DNA i en celle i vid udstrækning anvendes som en enkel, ligetil proces, der kræver forholdsvis lidt tid og materialer. Endvidere succesraten af celler, der undergår transfektion er høj ^7. Denne teknik er meget pålidelig, når det kombineres med et markørgen, såsom grønt fluorescerende protein (GFP), og kan anvendes til mange forskellige teknikker, såsom calcium imaging og elektrofysiologi ^5. Men desværre transient ekspression af DNA i værtsceller kommer med nogle store faldgruber, ikke mindst, at ekspressionsniveauet per celle er upålidelig. Antallet af kopier af plasmid-DNA taget up per celle er ukontrollabel, således at udtrykket mellem individuelle eksperimenter kan variere meget ^2. Dette problem bliver signifikant, når enten forsøger at replikere fysiologiske forhold, eller udfører præcise dataindsamlingsteknikker.

Som en løsning på de ovennævnte, stabil transfektion protokoller er blevet designet komplikationer, hvor et gen af ​​interesse kan indsættes i genomet af en celle under den stramme kontrol af en inducerbar promotor, såsom en tetracyclin repressor ekspressionssystem, sikrer en enkelt kopi af plasmidet integreres i genomet i hver celle og kun udtrykkes efter induktion af transskription mekanisme, for eksempel i nærvær af doxycyclin. Mens dette løser forhindringer af inkonsekvente protein udtryk niveauer, denne metode mister bekvemmelighed hurtig og relativt simpel protokol af transiente transfektioner. Etablering af en stabil cellelinje tager mindst et par uger i which må man kalibrere en dræbende kurve indstillet af specifikke antibiotika for at bevare proteinekspression og sikre integration af vektoren og dygtigt vælge og vokse cellekolonier. Samlet set tager betydeligt mere tid og kræfter med en lavere succesrate ^8.

Her introducerer vi en mellemliggende protokol, der trækker på styrkerne i begge de populære transfektion muligheder for at skabe en enkel og effektiv måde at styre ekspressionsniveauerne i enhver inducerbare cellelinje. Samtidig opretholde celler med et inducerbart tet systemet, vi forbigående transficere vores gen af ​​interesse, Transient Receptor Potential kationkanal underfamilien V element 1 (TRPV1), ligeret ind i en vektor, som homologt kan kombinere med repressoren system. På denne måde kan genet indføres i cellerne uden begyndt at udtrykke. Kun ved tilsætning af doxycyclin betyder genet begynde at udtrykke, tillader os at kalibrere niveauet af protein expression ifølge teknikken eller niveauer observeret i fysiologiske betingelser. Vores protokol undgår også langvarige komplikationer forbundet med generering af en stabilt udtrykkende cellelinie. Vi begynder med at vise de skiftende niveauer af TRPV1 aktivering i calcium imaging fra un-induceret gennem fire timers induktion og hvordan stigningen i intracellulære calcium niveauer korrelerer. Vi derefter duplikere protokollen i hele celle konfiguration af patch-clamp teknik, viser den stigende strøm med stigende tid af induktion. Endelig præsenterer vi eksempler på enkelt kanal elektrofysiologi optagelser, og vise, at denne teknik er især nyttig for kontrolleret udtryk, når de søger præcis dataindsamling baseret på individuelle enheder af proteinet. Gennem vores protokol, tilbyder vi en bekvem måde at styre proteinekspression i heterologe systemer samtidig undgå langvarige cellekultur komplikationer, hvilket giver en måde at kontrollere forhold mellem eksperimenter og give more reproducerbare resultater.

Protocol

1. ligering af genet af interesse i det repressible Site of Vector Få en inducerbar vektor såsom pcDNA5 / FRT / TO eller pcDNA4 / TO. Analyser genet af interesse for alle potentielt modtagelige restriktionssteder i midten af genet, der ligeledes i den multiple kloningssted i den valgte vektor ved in silico DNA-analyse software 4. Anvendelse af standard overlappende PCR-teknikker 4, flankerer genet af interesse med to udvalgte restr…

Representative Results

For hurtigt at oprette en inducerbar ekspression model, gjorde vi brug af HEK293-celler, der udtrykker Tetracyklin repressorproteinet (TR) (f.eks T-Rex-293) og vektorer, der indeholder tetracyklin operator sekvenser (TetO) mellem CMV-promotoren og det multiple kloningssted (f.eks pcDNA4 / TO). Når transficeret ind Trex-293-celler, er ekspressionen af ​​genet af interesse i pcDNA4 / TO undertrykt, som TR binder til TetO. Tilføjelse doxycyclin til mediet forhindrer …

Discussion

Transfektion er et meget anvendt protokol for proteinekspression og forskning, med mange forskellige variationer til forbedring ekspression konsistens og stabilitet. Forbigående transfektionsreagenser tilbyder en enkel, let at bruge protokol, hvor cellen og proteinet af interesse kan analyseres i løbet af timer til natten over fra tidspunktet for transfektion. Desværre denne fremgangsmåde kan være uforudsigelig, når den tilstand af analyse kræver et ensartet proteinekspression, såsom enkelt kanal optagelser i el…

Materials

pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler	Esco	n.a
Restriction Enzymes	ThermoScientific Fisher	ER0501
Agarose	Lonza	50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	ThermoScientific Fisher	ND-2000C
T4 DNA Ligase	ThermoScientific Fisher	EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli	ThermoScientific Fisher	C404006
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Bio	A-301-5
Tryptone for microbiology	Merck	6.19305E+13
Yeast Extract	BD worldwide	212750
SIF6000R Incubated Shaker	LAB COMPANION	45H118
NucleoSpin®plasmid	Macherey Nagel	740588.25
MS 300V Power Supply	Major Science	MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System	ThermoScientific Fisher	B1A
T-REx™-293 cell line	Invitrogen	R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose)	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® Buffer	NEB	B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin	Gibco	10270106
HEPES Buffer Solution (1 M)	Biological Industries	03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)	Biological Industries	03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator	ThermoScientific Fisher	51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet	ThermoScientific Fisher	51025411
Blasticidine S hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER	Hausser Scientific	31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round	Knittel Glass	GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine	Corning	354210
Water, Cell Culture Grade	Biological Industries	03-055-1A
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM ester	Biotium	BTM-50034
Pluronic® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-Slide 8 Well	ibidi	80826
(E)-Capsaicin	Tocris	462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope	Olympus	n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher	Sutter Instruments	n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera	QImaging	n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software	Molecular Devices	n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma-Aldrich	276855
P1000 micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 Microforge	NARISHIGE	n.a
ValveBank perfusion sysytem	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System	Molecular Devices	n.a
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	n.a
pCLAMP 10.6 Software	Molecular Devices	n.a
micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225