유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식
Summary
이종 발현 시스템을 통해 공부하는 이온 채널은 생물 의학 연구의 핵심 기술이되고있다. 이 논문에서는, 유도 성 프로모터의 조절하에 일시적인 형질 감염을 수행함으로써 엄격하게 제어 이온 채널 표현을 달성하는 시간 효율적인 방법을 제안한다.
Abstract
형질는 셀에 외국 핵산의 전달, 단백질 연구에 강력한 도구입니다. 이 방법으로, 이온 채널은 전기 생리 학적 분석, 생화학 적 특성화 돌연변이 연구 및 세포 과정에 미치는 영향을 조사 할 수있다. 과도 형질은 단백질이 일 몇 시간 내에 분석을 위해 사용할 수있는 간단한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 비교적 간단하고 시간 효율적인 프로토콜을 제공하지만, 중요한 요소 중 하나가 분석하기에 적합한 생리 학적 관련성 레벨 또는 레벨 관심의 유전자의 발현을 교정한다. 이를 위해, 관심의 유전자의 발현을 조절하는 능력을 제공하는 여러 접근 방식이 등장했다. 여러 안정 세포 형질 감염 프로토콜 영구적 테트라 사이클린 조절 transcrip의 조절하에 세포의 게놈으로 관심의 유전자를 도입하는 방법을 제공한다적인 활성화. 이 기술은 안정적인 발현 수준을 생산하고 있지만, 관심있는 각각의 유전자는 살인 곡선의 교정, 세포 콜로니의 선택, 전체 더 많은 자원을 포함하여 숙련 된 작업의 몇 주를 필요로한다. 여기에서는, 이온 채널 분석에 필수적인 제어 된 방식으로 단백질을 발현 할 수있는 효율적인 방법으로 유도 시스템의 일시적 수용체 전위 양이온 채널 아과의 V 부재 (1) (TRPV1) 유전자의 일시적인 형질 감염을 사용하는 프로토콜을 제시한다. 우리는이 기술을 이용하여, 우리는 하나의 형질 전환과 데이터 수집의 각 유형에 필요한 제어 채널 레벨 칼슘 이미징, 전체 셀 및 단일 채널 분석을 수행 할 수 있다는 것을 보여준다. 전반적으로, 이는 이온 채널 구조 및 기능을 연구하기 위해 사용될 수있는 복제 기술을 제공한다.
Introduction
이종 시스템을 발현하는 세포의 기능 (1)의 다수의 연구에 가장 널리 사용되는 기술 중 하나이다. 낮은 내인성 단백질 프로파일, 최소한의 유지 보수 요구 사항, 안정적인 성장, 외국 DNA를 가지고 표현하는 능력은 인간 배아 신장 (HEK293) 및 생물학 연구 2, 3과 거의 필수 중국어 햄스터 난소 (CHO)와 같은 세포 라인을 만들었습니다. 이종 시스템을 사용하는 연구 분야는 막 단백질, 세포 내 신호 및 효소 활성을 포함한다. 세포 내로 외래 DNA의 형질 전환에 따라, 분석의 많은 다른 형태의 전기 생리학, 비율 적 칼슘 이미징, 웨스턴 블롯 등 4, 5를 포함하여 수행 될 수있다.
이종 발현 시스템에 대한 잠재적 인 응용 프로그램의 다양한에 많은 differe 인해NT 시약 및 산물이 세포 및 자질 6을 이용하도록 개발되었다. 일시적 또는 영구적으로 외래 단백질을 연구하는 세포로 외국 DNA를 통합 DNA 전달 시스템 생물학 연구를위한 가장 인기있는 유용한 도구 중 하나가되고있다. 구체적으로는, 세포에 일시적으로 형질 DNA 널리 비교적 짧은 시간 및 재료를 필요로하는 단순 직진 처리로서 사용된다. 또한, 형질 감염을 겪는 세포들의 성공률 7 높다. 이 기술은 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 마커 유전자와 결합 및 칼슘 이미징 및 전기 생리학 (5)와 같은 다양한 기술을 사용할 수있는 경우 매우 안정하다. 불행하게도하지만, 일시적으로 숙주 세포에 DNA를 발현하는 것은 셀 당 발현 수준이 신뢰할 그 이상으로, 몇 가지 주요 함정이 함께 제공됩니다. 플라스미드 DNA의 카피 수는 U 촬영셀 당 p는 따라서 개별 실험의 표현은 크게 2 다를 수 있습니다, 제어 할 수없는 것입니다. 어느 생리적 조건을 복제하려고하거나 정확한 데이터 수집 기술을 수행 할 때 이러한 문제가 현저해진다.
단일 보장 관심의 유전자와 같은 테트라 사이클린 리프레 발현 시스템과 같은 유도 성 프로모터의 엄격한 제어하에 세포의 게놈 내로 삽입 될 수있는, 안정된 형질 감염 프로토콜이 설계되어 전술 한 합병증에 대한 해결책으로서, 플라스미드의 카피가 각 세포의 게놈에 통합 만 독시사이클린의 존재 하에서, 예를 들면, 전사기구의 유도 후 발현된다. 이 불일치 단백질 발현 수준 장애를 해결하지만,이 방법은 일시적 형질 빠르고 비교적 간단한 프로토콜의 편의를 잃는다. 안정적인 세포주를 수립하는 것은 whic 적어도 몇 주 소요H 하나는 단백질 발현을 유지하고 벡터의 통합을 위해 선택 솜씨 세포 콜로니를 성장 특정 항생제에 의해 설정된 사멸 곡선을 보정한다. 전반적으로이 낮은 성공률 8 훨씬 많은 시간과 노력이 필요.
여기서는 어떤 유도 세포주에서의 발현 수준을 제어하기위한 간단하고 효과적인 방법을 제공하는 대중적인 형질 전환 방법 중 모두의 장점을 그리는 중간 프로토콜을 소개한다. 유도 TET 시스템 셀을 유지하면서, 우리는 일시적 동성 리프레 시스템과 결합 할 수있는 벡터에 라이 게이션 관심 우리 유전자 일시적 수용체 전위 양이온 채널 아과의 V 부재 (1) (TRPV1)를 형질. 이러한 방식으로, 유전자를 발현하기 시작하지 않고 세포 내로 도입 될 수있다. 독시사이클린 만의 첨가로 유전자 단백질 EXPR의 레벨을 보정 할 수 있도록 허락 표현하기 시작 않는다생리적 조건에서 관찰되는 기술 또는 레벨에 따라 ession. 우리 프로토콜은 또한 안정적으로 발현하는 세포주를 생성과 관련된 긴 합병증을 피할 수있다. 우리는에서 칼슘 이미징에서 TRPV1 활성화의 변화 수준을 보여주는 것으로 시작되지 않은 유도 유도하는 방법과 세포 내 칼슘 농도의 증가는 상관 관계가 4 시간을 통해. 그런 다음 유도 시간이 증가함에 따라 증가하는 전류를 나타내는 패치 클램프 기술의 전체 셀 구성 프로토콜 중복. 마지막으로, 단일 채널 전기 생리학 기록의 예를 제시하고, 단백질의 각각의 단위에 기초하여 정확한 데이터 수집을 찾을 때이 기술은 발현 조절에 특히 유용하다 보여준다. 따라서 실험 제공 MO과 조건을 제어하는 방법을 제공하고, 긴 세포 배양 합병증을 피하면서 우리 프로토콜을 통해, 우리는 이종 시스템에서 단백질 발현을 조절하기위한 편리한 방법을 제공한다복제 결과를 다시.
Protocol
Representative Results
Discussion
형질 발현 일관성과 안정성을 향상시키기 위해 여러 가지 변형 단백질 발현 연구에 널리 사용되는 프로토콜이다. 일시적 형질 전환 시약은 쉽고 간단한 관심 세포 단백질은 형질 감염 시간 내지 밤새 시간 이내에 분석 할 수있는 프로토콜을 사용하도록 제안한다. 분석의 모드는 전기 생리학 2의 단일 채널 녹음 등의 단백질 발현의 일관된 수준을 필요로하는 경우 불행하게도이 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 (AP에) 이스라엘 과학 재단 [보조금 12분의 1,721, 12분의 1,368, 및 16분의 1,444]에 의해 지원되었다. AP는 Brettler 센터와 데이비드 R. 블룸 센터, 약학 대학, 예루살렘의 히브리 대학과 연관되어있다.
Materials
| pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102020 | |
| pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V103320 | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Swift™ MaxPro Thermal Cycler | Esco | n.a | |
| Restriction Enzymes | ThermoScientific Fisher | ER0501 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoScientific Fisher | ND-2000C | |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific Fisher | EL0011 | |
| One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli | ThermoScientific Fisher | C404006 | |
| Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Bio | A-301-5 | |
| Tryptone for microbiology | Merck | 6.19305E+13 | |
| Yeast Extract | BD worldwide | 212750 | |
| SIF6000R Incubated Shaker | LAB COMPANION | 45H118 | |
NucleoSpin®plasmid |
Macherey Nagel | 740588.25 | |
| MS 300V Power Supply | Major Science | MP-300V | |
| Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System | ThermoScientific Fisher | B1A | |
| T-REx™-293 cell line | Invitrogen | R710-07 | |
| DMEM (1X), liquid (high glucose) | Gibco | 41965-039 | |
| HindIII-HF® | NEB | R3104S | |
| ApaI | NEB | R0114S | |
| CutSmart® Buffer | NEB | B7204S | |
| pcDNA™6/TR Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102520 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco | 10270106 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) | Biological Industries | 03-022-1B | |
| Heracell™ 150i CO2 Incubator | ThermoScientific Fisher | 51026406 | |
| MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet | ThermoScientific Fisher | 51025411 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205-25MG | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER | Hausser Scientific | 31000 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| TransIT®-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round | Knittel Glass | GG-12 | |
| BioCoat™ Poly-D-Lysine | Corning | 354210 | |
| Water, Cell Culture Grade | Biological Industries | 03-055-1A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Fura-2, AM ester | Biotium | BTM-50034 | |
| Pluronic® F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| µ-Slide 8 Well | ibidi | 80826 | |
| (E)-Capsaicin | Tocris | 462 | |
| Olympus IX70 Fluorescence Microscope | Olympus | n.a | |
| Lambda DG-4 Wavelength Switcher | Sutter Instruments | n.a | |
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera | QImaging | n.a | |
| MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software | Molecular Devices | n.a | |
| Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-110-7.5HP | |
| Standard Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-7.5HP | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MF-900 Microforge | NARISHIGE | n.a | |
| ValveBank perfusion sysytem | AutoMate Scientific | ||
| Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System | Molecular Devices | n.a | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | n.a | |
| pCLAMP 10.6 Software | Molecular Devices | n.a | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 |
References
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