Inducible क्षणिक अभिकर्मक के माध्यम से चलाया आयन चैनल अभिव्यक्ति
Summary
एक heterologously व्यक्त प्रणाली के माध्यम से अध्ययन आयन चैनल जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक कोर तकनीक बन गया है। इस पांडुलिपि में, हम एक inducible प्रमोटर के नियंत्रण के तहत क्षणिक अभिकर्मक प्रदर्शन से कसकर नियंत्रित आयन चैनल अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए एक समय कुशल तरीका मौजूद है।
Abstract
अभिकर्मक, एक सेल में विदेशी न्यूक्लिक एसिड का वितरण, प्रोटीन अनुसंधान के क्षेत्र में एक शक्तिशाली उपकरण है। इस विधि के माध्यम से, आयन चैनल electrophysiological विश्लेषण, जैव रासायनिक लक्षण वर्णन, mutational अध्ययन, और सेलुलर प्रक्रियाओं पर उनके प्रभाव के माध्यम से जांच की जा सकती है। क्षणिक transfections एक साधारण प्रोटोकॉल जिसमें प्रोटीन दिनों के लिए कुछ ही घंटों के भीतर विश्लेषण के लिए उपलब्ध हो जाता है प्रदान करते हैं। हालांकि इस पद्धति का एक अपेक्षाकृत सरल और समय कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, महत्वपूर्ण घटकों में से एक शारीरिक प्रासंगिक स्तर या स्तर है कि विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं के लिए ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति औजार है। यह अंत करने के लिए कई अलग अलग दृष्टिकोण है कि ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने की क्षमता प्रदान करते उभरा है। कई स्थिर सेल अभिकर्मक प्रोटोकॉल एक तरह से स्थायी रूप से एक टेट्रासाइक्लिन नियंत्रित transcrip के नियमन के तहत सेलुलर जीनोम में ब्याज की एक जीन लागू करने के लिए प्रदान करते हैंराष्ट्रीय सक्रियण। हालांकि इस तकनीक विश्वसनीय अभिव्यक्ति के स्तर पैदा करता है, ब्याज की प्रत्येक जीन एक की हत्या की अवस्था की जांच, सेल कालोनियों के चयन, और समग्र और अधिक संसाधनों सहित कुशल काम के कुछ ही सप्ताह की आवश्यकता है। यहाँ हम एक प्रोटोकॉल एक कारगर तरीका एक नियंत्रित तरीके से जो आयन चैनल विश्लेषण करने में आवश्यक है में एक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए के रूप में एक inducible प्रणाली में क्षणिक रिसेप्टर संभावित केशन चैनल उपप्रजाति वी सदस्य 1 (TRPV1) जीन के क्षणिक अभिकर्मक का उपयोग करता है प्रस्तुत करते हैं। हम दिखाना है कि इस तकनीक का उपयोग, हम नियंत्रित चैनल एक एकल अभिकर्मक के साथ डेटा संग्रह के प्रत्येक प्रकार के लिए आवश्यक स्तर के साथ कैल्शियम इमेजिंग, पूरे सेल, और एक चैनल विश्लेषण प्रदर्शन करने में सक्षम हैं। कुल मिलाकर, यह एक दोहराया कि तकनीक आयन चैनल संरचना और समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
Heterologously व्यक्त सिस्टम सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की तकनीक सेलुलर कार्यों 1 के एक भीड़ का अध्ययन करने से एक है। उनके कम अंतर्जात प्रोटीन प्रोफाइल, कम से कम रखरखाव आवश्यकताओं, विश्वसनीय विकास, और हाथ में ले लिया और विदेशी डीएनए व्यक्त करने की क्षमता में इस तरह के मानव भ्रूण गुर्दे (HEK293) और चीनी हैम्स्टर अंडाशय (चो) जैविक अनुसंधान के 2, 3 के लिए लगभग अनिवार्य रूप सेल लाइनों बना दिया है। heterologous सिस्टम का उपयोग कर अनुसंधान के क्षेत्रों झिल्ली प्रोटीन, intracellular संकेतन, और enzymatic गतिविधि में शामिल हैं। सेल में विदेशी डीएनए के अभिकर्मक के बाद के विश्लेषण के कई अलग अलग रूपों इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, ratiometric कैल्शियम इमेजिंग, पश्चिमी धब्बा, आदि 4, 5, सहित किया जा सकता है।
heterologous अभिव्यक्ति की व्यवस्था के लिए संभावित आवेदनों की एक विस्तृत सरणी के लिए, कई विभिन्न कारणNT अभिकर्मकों और उत्पादों इन कोशिकाओं और उनके गुणों 6 उपयोग करने के लिए विकसित किया गया है। डीएनए वितरण प्रणाली है कि क्षणिक या स्थायी रूप से कोशिकाओं में विदेशी डीएनए एकीकृत exogenous प्रोटीन का अध्ययन करने के जैविक अनुसंधान के लिए सबसे लोकप्रिय और उपयोगी उपकरणों में से एक बन गया है। अधिक विशेष रूप से, एक सेल में क्षणिक परासंक्रमित डीएनए व्यापक रूप से एक सरल, सीधे आगे की प्रक्रिया है कि अपेक्षाकृत कम समय और सामग्री की आवश्यकता के रूप में प्रयोग किया जाता है। इसके अलावा, कोशिकाओं की सफलता दर है कि अभिकर्मक से गुजरना उच्च 7 है। यह तकनीक बहुत विश्वसनीय है जब इस तरह हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में एक जीन मार्कर के साथ संयुक्त, और जैसे कैल्शियम इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी 5 के रूप में कई विभिन्न तकनीकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, हालांकि, क्षणिक मेजबान कोशिकाओं में डीएनए को व्यक्त करने के कुछ प्रमुख नुकसान से, कम से कम नहीं है कि सेल प्रति अभिव्यक्ति के स्तर अविश्वसनीय है में आता है। प्लास्मिड डीएनए की प्रतियों की संख्या यू लियासेल प्रति पी बेकाबू है, इस प्रकार अलग-अलग प्रयोगों के बीच अभिव्यक्ति की बहुत 2 भिन्न हो सकते हैं। जब या तो शारीरिक शर्तों को दोहराने की कोशिश, या सटीक डेटा संग्रह तकनीकों प्रदर्शन कर इस मुद्दे महत्वपूर्ण हो जाता है।
जटिलताओं से ऊपर उल्लेख किया है, स्थिर अभिकर्मक प्रोटोकॉल डिजाइन किया गया है, जिसमें ब्याज की एक जीन में इस तरह के एक टेट्रासाइक्लिन repressor अभिव्यक्ति प्रणाली के रूप में एक inducible प्रमोटर की तंग नियंत्रण के अधीन एक कोशिका के जीनोम में डाला जा सकता है के लिए एक समाधान है, एक भी सुनिश्चित रूप प्लाज्मिड की प्रतिलिपि प्रत्येक कोशिका के जीनोम में एकीकृत करता है और केवल प्रतिलेखन तंत्र के शामिल होने के बाद डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति में, उदाहरण के लिए, व्यक्त की है। इस असंगत प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की बाधाओं को हल करती है, वहीं इस विधि क्षणिक transfections का त्वरित और अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल की सुविधा खो देता है। एक स्थिर सेल लाइन की स्थापना जो में कम से कम कुछ सप्ताह लग जाते हैंज एक एक की हत्या वक्र विशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं द्वारा निर्धारित प्रोटीन अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए और वेक्टर के एकीकरण को सुनिश्चित करने और कुशलता का चयन करें और सेल कालोनियों बढ़ने जांचना चाहिए। कुल मिलाकर यह एक कम सफलता दर 8 के साथ काफी अधिक समय और प्रयास लेता है।
यहाँ, हम एक मध्यवर्ती प्रोटोकॉल है कि लोकप्रिय अभिकर्मक विकल्पों में से दोनों की ताकत पर छोड़ता है किसी भी inducible सेल लाइन में अभिव्यक्ति के स्तर को नियंत्रित करने के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका प्रदान करने के लिए परिचय। एक inducible tet प्रणाली के साथ कोशिकाओं को बनाए रखते हुए, हम क्षणिक ब्याज की हमारे जीन, क्षणिक रिसेप्टर संभावित केशन चैनल उपप्रजाति वी सदस्य 1 (TRPV1), एक वेक्टर कि homologously repressor प्रणाली के साथ गठबंधन कर सकते हैं में ligated transfect। इस तरह, जीन व्यक्त करने के लिए शुरुआत के बिना कोशिकाओं में पेश किया जा सकता है। केवल डॉक्सीसाइक्लिन के अलावा के साथ जीन प्रोटीन expr के स्तर को जांच करने के लिए हमें की अनुमति का इजहार करने के लिए शुरू होता है,तकनीक या शारीरिक स्थितियों में मनाया स्तर के अनुसार ession। हमारी प्रोटोकॉल भी एक स्थिरतापूर्वक व्यक्त सेल लाइन पैदा करने के साथ जुड़े लंबा जटिलताओं से बचा जाता है। हम से कैल्शियम इमेजिंग में TRPV1 सक्रियण के बदलते स्तर दिखा द्वारा शुरू करते हैं संयुक्त राष्ट्र प्रेरित प्रेरण और कैसे intracellular कैल्शियम के स्तर में वृद्धि संबद्ध के चार घंटे के माध्यम से। हम तो पैच दबाना तकनीक के पूरे सेल विन्यास में प्रोटोकॉल नकल, प्रेरण के समय में वृद्धि के साथ वर्तमान में वृद्धि को दर्शाता है। अंत में, हम एक चैनल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के उदाहरण प्रस्तुत करते हैं, और दिखाने के लिए इस तकनीक को नियंत्रित अभिव्यक्ति के लिए विशेष रूप से उपयोगी है कि जब प्रोटीन की अलग-अलग इकाइयों के आधार पर सटीक डाटा संग्रह के लिए लग रही है। हमारे प्रोटोकॉल के माध्यम से, हम heterologous प्रणालियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है, जबकि लंबी सेल संस्कृति की जटिलताओं से बचने के लिए, इस प्रकार के प्रयोगों और प्रदान मो के बीच की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए एक तरह से उपलब्ध कराने की पेशकश करते हैंदोहराया परिणाम रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
अभिकर्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति और अनुसंधान के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल, अभिव्यक्ति निरंतरता और स्थिरता में सुधार करने के लिए कई अलग अलग रूपों के साथ है। क्षणिक अभिकर्मक अभिकर्मकों ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम में इसराइल विज्ञान फाउंडेशन [अनुदान 1721-1712, 1368-1312, 1444-1416 और] (एपी) द्वारा समर्थित किया गया। एपी Brettler केंद्र और डेविड आर ब्लूम केंद्र, फार्मेसी के स्कूल, जेरूसलम के हिब्रू विश्वविद्यालय के साथ संबद्ध है।
Materials
| pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102020 | |
| pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V103320 | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Swift™ MaxPro Thermal Cycler | Esco | n.a | |
| Restriction Enzymes | ThermoScientific Fisher | ER0501 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoScientific Fisher | ND-2000C | |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific Fisher | EL0011 | |
| One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli | ThermoScientific Fisher | C404006 | |
| Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Bio | A-301-5 | |
| Tryptone for microbiology | Merck | 6.19305E+13 | |
| Yeast Extract | BD worldwide | 212750 | |
| SIF6000R Incubated Shaker | LAB COMPANION | 45H118 | |
NucleoSpin®plasmid |
Macherey Nagel | 740588.25 | |
| MS 300V Power Supply | Major Science | MP-300V | |
| Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System | ThermoScientific Fisher | B1A | |
| T-REx™-293 cell line | Invitrogen | R710-07 | |
| DMEM (1X), liquid (high glucose) | Gibco | 41965-039 | |
| HindIII-HF® | NEB | R3104S | |
| ApaI | NEB | R0114S | |
| CutSmart® Buffer | NEB | B7204S | |
| pcDNA™6/TR Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102520 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco | 10270106 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) | Biological Industries | 03-022-1B | |
| Heracell™ 150i CO2 Incubator | ThermoScientific Fisher | 51026406 | |
| MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet | ThermoScientific Fisher | 51025411 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205-25MG | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER | Hausser Scientific | 31000 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| TransIT®-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round | Knittel Glass | GG-12 | |
| BioCoat™ Poly-D-Lysine | Corning | 354210 | |
| Water, Cell Culture Grade | Biological Industries | 03-055-1A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Fura-2, AM ester | Biotium | BTM-50034 | |
| Pluronic® F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| µ-Slide 8 Well | ibidi | 80826 | |
| (E)-Capsaicin | Tocris | 462 | |
| Olympus IX70 Fluorescence Microscope | Olympus | n.a | |
| Lambda DG-4 Wavelength Switcher | Sutter Instruments | n.a | |
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera | QImaging | n.a | |
| MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software | Molecular Devices | n.a | |
| Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-110-7.5HP | |
| Standard Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-7.5HP | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MF-900 Microforge | NARISHIGE | n.a | |
| ValveBank perfusion sysytem | AutoMate Scientific | ||
| Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System | Molecular Devices | n.a | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | n.a | |
| pCLAMP 10.6 Software | Molecular Devices | n.a | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 |
References
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