Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genereren van iPSC afgeleide Human Brain Organoids naar Early Neurodevelopmental Disorders Model

20.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55372

⸱

14 april 2017

 , 
1Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne, 2Institute for Biochemistry I, Medical School of University of Cologne

In dit artikel

Samenvatting

Het modelleren van de ontwikkeling van de menselijke hersenen is belemmerd door de ongekende complexiteit van neurologisch epitheelweefsel. Hier wordt een methode beschreven voor de robuuste generatie van hersenorganoïden om vroege gebeurtenissen van de menselijke hersenontwikkeling af te bakenen en om microcefalie in vitro te modelleren.

Samenvatting

De beperkte beschikbaarheid van geschikte in vitro modellen die betrouwbaar complexe menselijke hersenontwikkeling kunnen vertegenwoordigen, is een belangrijke bottleneck die de vertaling van fundamenteel hersenonderzoek naar klinische toepassing beperkt. Hoewel geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) de ethisch omstreden menselijke embryonale stamcellen hebben vervangen, blijven iPSC-gebaseerde neuronale differentiatiestudies beschrijvend op cellulair niveau, maar slagen ze er niet in om adequaat de details te bieden die zouden kunnen worden afgeleid van een complex, 3D menselijk hersenweefsel.

Deze lacune wordt nu opgevuld door de toepassing van iPSC-afgeleide, 3D hersenorganoïden, "Hersenen in een schaal", die veel kenmerken van complexe menselijke hersenontwikkeling modelleren. Hier wordt een methode beschreven voor het genereren van iPSC-afgeleide, 3D hersenorganoïden. De organoïden kunnen helpen bij het modelleren van autosomaal recessieve primaire microcefalie (MCPH), een zeldzame menselijke neurodevelopmentele stoornis. Een algemeen aanvaarde verklaring voor de hersenmisvorming in MCPH is een uitputting van de neurale stamcelpool tijdens de vroege stadia van de menselijke hersenontwikkeling, een ontwikkelingsdefect dat moeilijk te recreëren of te bewijzen is in vitro.

Om MCPH te bestuderen, hebben we iPSC's gegenereerd uit patiëntafkomstige fibroblasten die een mutatie dragen in het centrosomaal eiwit CPAP. Door de ventrikelzone van microcefalie 3D hersenorganoïden te analyseren, toonden we de voortijdige differentiatie van neurale progenitors. Deze 3D hersenorganoïden zijn een krachtig in vitro systeem dat instrumenteel zal zijn bij het modelleren van aangeboren hersenaandoeningen veroorzaakt door neurotoxische chemicaliën, neurotrofe virale infecties of erfelijke genetische mutaties.

Inleiding

Menselijke neurologische stoornissen, zoals microcefalie, kan slechts slecht worden bestudeerd in diermodellen vanwege het feit dat de menselijke hersenen een verlengd corticale oppervlak, een unieke eigenschap die verschilt van niet-humane dieren.

Dit aspect maakt de ontwikkeling van menselijke hersenen een complex proces dat niet voldoende kan worden onderzocht in een 2D in vitro celcultuur. Opkomst 3D kweektechnieken kan de vorming van weefselachtige organoids van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). De in vitro differentiatie van pluripotente stamcellen in een 3D suspensiekweek maakt de vorming van verschillende celtypen tijdig en regiospecifieke wijze, hetgeen leidt tot een georganiseerde, gelaagd weefsel 1, 2, 3. Met dank aan laboratoria die 3D-cultuur technologieën pionier en gedemystificeerd de complexiteit van de formatie orgel, uitgaande van stamcellen,ontwikkelden we een robuuste werkwijze voor het genereren hersenen organoids vroege gebeurtenissen van ontwikkeling van menselijke hersenen af te bakenen en microcefalie model in vitro 1, 2, 3. Het is opmerkelijk dat we pasten de originele methode ontwikkeld door Lancaster et al. cerebrale organoids 1 genereren. Deze werkwijze werd gemodificeerd volgens onze experimentele eisen.

Het doel van een studie van Gabriel et al. was om de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurale stamcellen onderhoud te analyseren tijdens de ontwikkeling van de hersenen. Om dit te doen, werd een mechanistische onderzoek uitgevoerd door het analyseren van neurale progenitorcellen (NPC) in 3D hersenen organoids afgeleid van een microcefalie patiënt 4. Deze patiënt had een mutatie in CPAP, een geconserveerd centrosomal proteïne noodzakelijk voor centrosome biogenese 5. Een algemeen aanvaard hypostelling is dat microcefalie is het gevolg van een afname van het NPC pool en dit zou te wijten ofwel celdood of differentiatie voortijdige 1, 6, 7, 8, 9.

Door het analyseren van de ventriculaire zone (VZS) van microcefalie hersenen organoids werd aangetoond dat een aanzienlijk aantal NPC ondergaan asymmetrische celdeling, anders dan de hersenen organoids verkregen uit een gezonde donor 4. Uitgebreide microscopische en biochemische analyses van microcefalie hersenen organoids onthulde een onverwachte rol voor de CPAP in tijdig cilia demontage 4. Specifiek wordt gemuteerd CPAP gekoppeld aan achtergebleven cilium demontage en vertraagde celcyclus opnieuw binnenkomen, wat leidt tot voortijdige differentiatie van NPC 4. Deze resultaten suggereren een rol voor cilia in microcefalie en thEIR betrokkenheid tijdens de neurogenese en de omvang van de hersenen controle 10.

Het eerste deel van dit protocol is een beschrijving van een drietrapsmethode homogene hersenen organoids genereren. Zoals eerder vermeld, is de oorspronkelijke Lancaster protocol aangepast en gemodificeerd om ons doel passen 1. Eerst, menselijke iPSCs gekweekt in een gedefinieerde toestand als feeder-on Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix. Deze stap vermijdt de variaties van feeder-afhankelijke pluripotente stamcel cultures. In dit protocol, het induceren van neuronale differentiatie onder vorming neurale epitheel begint direct vanuit iPSCs. Sla de embryoiden lichaam (EB) vormingsstap, het neurale differentiatie verloopt in een gecontroleerde en gerichte wijze. Deze aanpak beperkt de spontane en ongestuurde vorming van andere kiemcellen lagen, zoals mesoderm en endoderm. Door toepassing van dit protocol kunnen neurosferen die neurale rozetten worden geoogst op dag 5 EHS matrix inbedden en stationaire suspensiekweek. De organoïde medium dat voor de derde stap van ons protocol is aangevuld met dorsomorphin en SB431542. Dorsomorphin is een klein molecuul remmer van botmorfogeenproteïne (BMP) en SB431542 remt de TGF / activine / nodale signaalroute. De combinatie van deze factoren kunnen neurale differentiatie efficiënter dan retinezuur alleen 11, 12, 13, 14 te bevorderen.

In totaal hebben deze modificaties maken de reproduceerbare vorming van hersenen organoids met minimale verschillen tussen organoids. Belangrijk is dat deze werkwijze toegepast op robuuste genereren microcefalie hersenen organoids van patiënt iPSCs die mutaties dragen in genen die centrosomes en celcyclus dynamica beïnvloeden.

Het tweede deel van dit protocol geeft instructies aan br voorbereidingain organoids voor de analyse en interpretatie van de cellulaire defecten in microcefalie. Dit omvat fixatie, cryosectioning, immunofluorescentie kleuring en confocale microscopische analyse. Dit protocol zal de lezer te voorzien van een gedetailleerde beschrijving van de verwachte resultaten en onder begeleiding voor interpretatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Generatie van Brain Organoids (23 dagen)

  1. Initiatie van neuroectoderm (5 dagen)
    OPMERKING: De volgende punten moeten worden overwogen vóór het begin van differentiatie. Herprogrammering methode (lentiviral-, sendai-virus, episomal- of microRNA-gebaseerde etc.) aan humane iPSCs verkrijgen idealiter hetzelfde voor alle patiënten en controle iPSC lijnen. Verschillende herprogrammering kits en instructies op basis van gepubliceerde protocollen beschikbaar 15, 16, 17, 18. De kwaliteit van het menselijk iPSC lijnen is de sleutel voor de realisatie van een optimale differentiatie. Bewaken kolonie celmorfologie met een microscoop en bevestig pluripotentie door het testen van de expressie van merkers zoals Oct3 / 4, Nanog of TRA-1-60.
    1. Humane iPSCs onder feeder-vrije omstandigheden in een medium op een schotel bekleed met Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matrix.
      OPMERKING: Grow menselijk iPSCs feeder-vrij en serum-vrij om een ​​bepaalde cultuur conditie te houden en om een ​​extra stap voor de verwijdering van muis embryonale feeder-cellen (MEF) voor de start van differentiatie te voorkomen. Het optimale aantal passages menselijke iPSCs differentiatie varieert gaan van doorgang 15 bij herprogrammering de doorgang 70 in totaal. Bij doorkweken, los iPSC koloniën cellen aggregeren gebruikmaking van een geschikte cel losraken oplossing met een lage spanning en een 2-mL serologische pipet aggregaten naar een nieuwe schaal. Vermijd dissociatie tot enkele cellen, als deze differentiatie en apoptose kan induceren in de meeste iPSC lijnen. Er werd gemeld dat op lange termijn, single-cell passage kon genomische veranderingen in de menselijke iPSCs 19, 20 te verhogen. Voorkomen loslaten van cellen te maken die een centrifugatiestap nodig losraken oplossing te verwijderen, omdat dit de levensvatbaarheid van iPSCs vermindert. Testalle culturen voor microbiële verontreinigingen, in het bijzonder mycoplasma, op regelmatige basis, omdat dit zou de kwaliteit van de iPSCs en hun differentiatie capaciteit te veranderen.
      1. Coat een 60 mm weefselkweek schotel met EHS matrix volgens de instructies van de fabrikant.
      2. Dooi een hoeveelheid van 1 x 10 6 menselijke iPSCs. Het zaad iPSCs in een 60 mm weefselkweekplaat bekleed EHS matrix en die 5 ml medium A (zie tabel Materials). Verander het medium dagelijks en passage na 5 tot 7 dagen wanneer de cellen bereiken ~ 80% confluentie.
        OPMERKING: Passage de ontdooide iPSCs bij 80% confluentie onder toepassing van standaardwerkwijzen, zoals de enzymvrije losmaken van kolonies 21, ten minste eenmaal voordat de differentiatie. Kortom verwijderen iPSC medium, was de cellen eenmaal met voorverwarmd 37 ° C Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), en incubeer de iPSCs na de fabrikantinstructies gebruiken reagens A (zie materialen tabel). Niet meer dan de aanbevolen incubatietijd om dissociatie om enkele cellen te voorkomen. Human iPSCs moet worden losgemaakt en drijvende als aggregaten, niet als afzonderlijke cellen. Zij kunnen vervolgens worden overgebracht naar nieuwe EHS-matrix beklede schalen; bijvoorbeeld iPSC aggregaten van een 60-mm plaat kan worden verdeeld 4 nieuwe 60-mm schaaltjes.
      3. Controleer of er mycoplasma met een mycoplasma detectie kit volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik alleen mycoplasmavrij iPSCs, zoals mycoplasma de differentiatie vermogen van iPSCs kan veranderen.
    2. Dissociëren iPSCs (80% confluent) en bereiden een eencellige suspensie gebruikt reagens B.
      1. Was de iPSCs eenmaal met voorverwarmde (37 ° C) DMEM / F12.
      2. Add voorverwarmde reagens B (bijvoorbeeld 1 ml in een 60 mm schaal) en incubeer de iPSCs gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
      3. Flick 20 keer met een vinger aan de zijkant en onderkant vande schotel naar de iPSCs los. Controleer voor het losmaken van de cellen onder de microscoop.
      4. Pipetteer de celsuspensie op en neer in de schaal 5 maal met 1 ml micropipet.
      5. Voeg 3 ml medium A verdund 1 ml reagens B en verzamel de celsuspensie in een 15 ml centrifugebuis.
      6. Voorzichtig spin down de iPSCs (500 xg) gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
      7. Resuspendeer de celpellet in 1 ml medium B en tel het aantal cellen met een hemocytometer.
        LET OP: Wees je bewust van het gebruik van alleen medium B voor resuspensie. Vermijd het gebruik medium A, omdat een te hoge concentraties van bFGF, die differentiatie kunnen remmen bevat.
    3. Verdun de celsuspensie tot 4,5 x 10 5 cellen per ml in medium B aangevuld met 10 pM rho-associated protein kinase inhibitor (Y-27632).
    4. Voeg 100 ul per putje in een niet-hechtende, v-bodem 96-well plaat.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen worden gelijk verdeeld in de suspensioen door schudden van de buis iedere keer voor het afsluiten van 100 ul porties. Het is belangrijk dat elke well een equivalent aantal cellen om neurosferen homogeen in grootte en vorm (rond, gedefinieerd oppervlakken) te verkrijgen moet bevatten.
    5. Voorzichtig spin down de plaat met de cellen bij 500 xg en kamertemperatuur gedurende 3 min en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
    6. Verander het medium dagelijks door het verwijderen van 50 ui en het toevoegen van 50 ul vers medium B in elk putje voor de komende 5 dagen.

2. Embedding Neurosferen in EHS Matrix (4 dagen)

  1. Bereid neurosfeer medium door mengen van de volgende: 1: 1 mengsel van DMEM / F12 en middelgrote C (v / v), 1: 200 (v / v) supplement 1, 1: 100 (v / v) supplement 2 zonder (w / o) Vitamine A, 1: 100 L-glutamine, 0,05 mM niet-essentiële aminozuren (MEM), 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 1,6 g / l insuline, en 0,05 mM β-mercaptoethanol.
  2. Verzamel de neurospheres witha 200 pl micropipet met gebruik van een tip mm ~ 2 werd gesneden met een steriele schaar.
  3. Plaats de neurosferen ongeveer 5 mm afstand van elkaar op paraffinefilm (3 x 3 cm2) in een lege 100 mm schaal en verwijder zoveel mogelijk van de resterende medium mogelijk.
  4. Voeg een druppel (7 uL) van EHS matrix op elke afzonderlijke neurosfeer.
  5. Incubeer de EHS matrix druppels met de neurosferen gedurende 15 minuten in een incubator.
  6. Was de neurospheres voorzichtig uit de paraffine film door hen te spoelen met neurosphere medium. Te spoelen, gebruik dan een 1 ml micropipet en een nieuwe 100 mm petrischaal met 10 ml neurosphere medium.
  7. Incubeer de neurospheres de komende 4 dagen en voeg 2 ml vers neurosphere medium op dag 2.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de schappen in de incubator zijn plat, zodat de EHS-matrix ingebed neurosferen niet samen aan een zijde van de schaal zal klonteren.

3. Organoids in een roterende SuspensionKweek (14 dagen)

  1. Bereid hersenen organoïde medium door mengen van de volgende: 1: 1 mengsel van DMEM / F12 en middelgrote C (v / v), 1: 200 (v / v) supplement 1, 1: 100 (v / v) supplement 2 w / o vitamine A, 1: 100 L-glutamine, 0,05 mM MEM, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 1,6 g / l insuline, 0,5 pM dorsomorphin, 5 uM SB431542 en 0,05 mM β-mercaptoethanol.
  2. Voeg 100 mL van hersenen organoïde medium aan elk centrifugekolf door de zijarmen en plaats ze in een incubator voorverwarmen gedurende ten minste 20 min.
  3. Opzetten van een programma roeren bij 25 rpm volgens de instructies van de fabrikant.
    LET OP: Voor het uitvoeren van de EHS-matrix ingebed neurospheres in spinner-flessen, zorg ervoor dat ze allemaal van elkaar gescheiden. Als twee of meer zijn via EHS matrix scheiden door het snijden van de verbindende matrix met een scalpel.
  4. Breng voorzichtig de EHS-matrix ingebed neurosferen in spinner kolven die 100 ml medium organoïde onsing 2 mL serologische pipet. Met de zijarmen van de centrifugekolf de neurosferen te zetten in de kolf.
  5. Plaats de spinner kolven op een platform magnetisch roeren in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2; dit is dag 0 van de organoïde cultuur.
  6. Verander het medium een ​​keer per week (of vaker als er een kleurverandering) door het verwijderen van de helft van het medium en het toevoegen van dezelfde hoeveelheid verse medium.
    OPMERKING: Bij het nemen van de spinner kolven uit de incubator, wacht 3-5 minuten te laten de organoids zinken naar de bodem van de kolf. Verwijder het medium door het plaatsen van het glas pipetpunt (verbonden met een pomp) op het oppervlak van de vloeistof; Zuig het medium voorzichtig door een zijopening / arm van de kolf. Deze manipulaties worden uitgevoerd onder laminaire afzuigkap.

4. Analyse van Brain Organoids

  1. Fixatie van organoids
    1. Verzamel de organoids op dag 14 van de centrifugekolf cultuur with a cut 1 ml micropipet (cut ~ 5 mm). Zet allemaal in een 60 mm schaal en wassen eenmaal met 5 ml warm DMEM / F12 gedurende 3 min.
    2. Bereid een 1,5 ml buis met 500 ui warm 4% paraformaldehyde (PFA).
      Let op: Draag huid en oogbescherming en werken onder een beschermkap bij het hanteren van PFA fixeermiddel.
    3. Plaats elke organoïde afzonderlijk in elke buis en bevestig ze gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Laat de organoids niet vast te stellen voor langer dan 60 min. De organoids verplaatsen gebruikt een entoog of andere bedenken dat handig.
    4. Verwijder de PFA en spoel de vaste organoids tweemaal gedurende 10 min elk 1 ml PBS.
    5. Bewaar het organoids in 1 ml PBS bij 4 ° C gedurende maximaal 7 dagen, tot verder gebruik.
  2. Inbedden van de organoids voor cryosectioning
    1. Verwijder de PBS en voeg 1 ml 30% sucrose in gedestilleerd water oplossing per tube naar organoids voor hen cryofreezing dehydrateren; na toevoeging Sucrose oplossing moet de organoids worden aan het wateroppervlak. Bewaar het organoids overnacht in sucroseoplossing bij 4 ° C; de volgende dag zou de organoids beneden gezonken naar de bodem van de buis.
      LET OP: Organoids kan worden opgeslagen voor maximaal 3-5 dagen bij 4 ° C in sucrose oplossing, indien nodig.
    2. Vul een vinyl exemplaar mal met 400 pl optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding en gebruik een entoog een organoïde in het middelpunt van de matrijs. Label de rand van de vorm met de naam sample.
    3. Bevries de organoïde-bevattende vorm bij -80 ° C tot cryosectioning.
    4. Coat glas cryoslides met 0,1% poly-L-lysine-oplossing (PLL) in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de objectglaasjes laat drogen gedurende 3 uur. Bewaar de dia's bij 4 ° C en warm ze tot kamer gematigd voor gebruik.
      OPMERKING: PLL-coating is een belangrijke stap, omdat het voorkomt dat de organoïde plakjes wegdrijven. Verzameld en opgeslagen PLL oplossing bij 4 ° C gedurende maximaal 3maanden. Voor hergebruik, filteren met een 0,22-um spuit en laat het warm tot kamertemperatuur.
    5. Sectie cryofrozen organoids in 20-50 urn dikke plakjes op PLL-beklede glazen cryoslides 22. Laat de dia's met de secties drogen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Bewaar de secties bij -80 ° C tot verdere verwerking.

5. Immunofluorescentie kleuring van secties organoïde

LET OP: Voor de algemene karakterisering van organoids, kleuring met nestin, een neurale marker, en TUJ1, een pan-neuronale marker, wordt aanbevolen. Als verdere voorbeelden, immunofluorescentiekleuring met fosfo-vimentine (p-Vim), die mitotische apicale radiale gliacellen labels en Arl13b voor cilium, worden beschreven. Om apoptose te testen, gebruik maken van de Terminal (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) assay. Plaats de dia's in een plastic doos tijdens de incubaties om ze te beschermen tegen stof, licht,en uitdroging.

  1. Ontdooi de objectglaasjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  2. Was de glaasjes tweemaal met 200 pi PBS-glycine (0,225 g glycine in PBS) gedurende 3 minuten om de PFA-geïnduceerde autofluorescentie doven.
  3. Permeabel de secties met 200 pl 0,5% Triton X100 / 0,1% Tween in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Was ze tweemaal met 200 pi PBS-glycine gedurende 3 min.
  5. Incubeer ze met 200 pl 0,5% visgelatine / 0,1% Triton X100 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C om niet specifieke antigeenbinding te blokkeren.
    OPMERKING: Indien een TUNEL assay vereist is, voert de test volgens het protocol van de fabrikant. Begin met de TUNEL-assay voor het uitvoeren van de immunokleuring, aangezien het zou kunnen interfereren met secundaire antilichamen en lessen fluoroforen wanneer achteraf gebruikt.
  6. Verdun de antilichamen in blokkeeroplossing bij de volgende concentraties: nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01:20; en secundaire antilichamen, 1: 1000.
  7. Incuberen met 200 ui van het eerste primaire antilichaam (bijvoorbeeld nestine) gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
  8. Was 3 x 3 minuten met 200 pl blokkeeroplossing.
  9. Verdun de eerste (anti-muizen-488) secundair antilichaam 1: 1000 in blokkerende oplossing en incubeer de slede in 200 uL gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur. Van nu af aan, altijd de dia's te beschermen tegen licht.
  10. Was 3 x 3 minuten met 200 pl blokkeeroplossing.
  11. Incuberen met 200 ui van het volgende primaire antilichaam (bijvoorbeeld TUJ1) gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
  12. Was 3 x 3 minuten met 200 pl blokkeeroplossing.
  13. Voeg 200 ul van het volgende secundaire antilichaam (anti-konijn 647) gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur.
  14. Was 3 x 3 min. met 200 pl blokkeeroplossing.
  15. Voeg 200 ul van 4' , 6-diamino-2-fenylindool (DAPI) bij 30 nM concentration in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur nucleaire kleuring.
  16. Was 2 x 3 min met 200 pl blokkeeroplossing.
  17. Was 1 x 1 min met 200 pl gedestilleerd water en laat de onderdelen drogen gedurende 10-20 minuten, totdat er geen duidelijke water druppel zichtbaar meer.
  18. Monteer de profielen met inbedding medium. Bewaar ze beschermd tegen licht bij 4 ° C gedurende maximaal enkele weken.
  19. Ga verder met microscopische analyse op de foto om een ​​overzicht van de organoïde, ventriculaire zone, primitief corticale plaat, en andere gebieden van belang.
  20. Gebruik een confocale microscoop met een 63x olie objectief en fluorescente filters, gekozen overeenkomstig de fluorescerende kleurstof gemerkte secundaire antilichamen gebruikt 1, 10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het genereren van hersenen organoids vereist ten minste drie weken continue kweek (Figuur 1A). Om reproduceerbare resultaten te bereiken, raden wij aan dat de onderzoeker documenteert elke stap en, belangrijker nog, vermijdt eventuele wijzigingen met betrekking tot medium componenten, tijdstippen, en de behandeling cel. Hier geven we een samenvatting van hoe om te evalueren of kritische mijlpalen zijn bereikt om organoids van voldoende kwaliteit aan het eind van het expe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

MCPH is een complexe menselijke neurologische aandoening die niet in dierlijke modellen kunnen worden gerecapituleerd in vivo of in eenvoudige menselijke celculturen benaderingen in vitro. De klinische manifestatie van MCPH begint te verschijnen tijdens het eerste trimester, toen de eerste neurogenese begint. Zo 3D hersenen organoids vertegenwoordigen een betrouwbaar experimenteel systeem om MCPH ontwikkelingsmodel. Bovendien 3D menselijke hersenen organoids een ideale benadering omdat i) zij maken de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Fritz Thyssen Foundation (Az.10.14.2.152). We zijn dankbaar voor het weefsel inbedding faciliteit en de microscoop kernfaciliteit van CMMC. We zijn dankbaar voor de besprekingen en technische steun van de leden van het Laboratorium voor centrosome en cytoskelet Biology. Wij danken Li Ming Gooi voor het nalezen van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-mouse 488InvitrogenA-11001Geit anti-Muis IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647InvitrogenA-21245Geit anti-Konijn IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 647
Arl13bproteintech17711-1-APARL13B konijn polyklonaal antilichaam 
CELLSPIN systeemIBS Integra Bioscience183001
DAPISigma-Aldrich, US326704',6-Diamidino-2-fenylindole dihydrochloride; meerdere leveranciers
DMEM/F-12Gibco, US31331093Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 
DorsomorphinSigma-Aldrich, USP5499Compound C; meerdere leveranciers
InbeddingsmediumAppliChemA9011, 0100Mowiol; inbeddingsmedium; meerdere leveranciers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrixCorning354277Matrigel hESC-gekwalificeerde matrix; belangrijk: hESC gekwalificeerd
Visgelatine Sigma-Aldrich, USG7765-250MLGelatine van koudgewater vishuid; meerdere leveranciers; autoclaveer na toevoeging aan PBS om op te lossen en te steriliseren, bewaar bij 4 °C
GlycineAppliChemA1067,1000Glycine voor moleculaire biologie; meerdere leveranciers 
Inoculatiestaaf met naald, wegwerpbaar (1 µL)Sigma Aldrich, USBR452201-1000EAmeerdere leveranciers 
InsulinSigma-Aldrich, USI3536-100MGmeerdere leveranciers
L-glutamineGibco, US25030081L-glutamine (200 mM)
Medium AStem cell technologies#05850mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium BStem cell technologies#05835Neural inductiemedium (NIM); neuraaal differentiatiemedium
Medium CGibco, US21103049Neural basaal medium
MEMGibco, US11140035MEM niet-essentiële aminozurenoplossing (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detectie KitLonza, Zwitserland#LT07-218Mycoplasma detectiekit; meerdere leveranciers
NestinNovus biologicalsNBP1-92717Nestin muis monoklonaal antilichaam (4D11)
Paraformaldehyde (PFA)AppliChemA3813, 05004% in PBS, oplossing bewaren bij -20 °C; voorzichtigheid: draag bescherming voor huid en ogen en werk onder de kap 
PBS-tablettenGibco, US18912014Zie instructies van de fabrikant; meerdere leveranciers
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)Gibco, US15140122Meerdere leveranciers
Poly-L-lysine-oplossing (PLL)Sigma-Aldrich, USP8920-100MLMeerdere leveranciers
pVimMBLD076-3SPhosfo-Vimentin (Ser55) mAb
Reagens A Stem cell technologies# 05872Opmerking bij Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzymvrij selectie- en passagereagens voor humane ES- en iPS-cellen); volg het protocol van de fabrikant; alternatieve producten van meerdere leveranciers beschikbaar
Reagens B Sigma-Aldrich, USA6964-100MLAccutase-oplossing is een enzymatische oplossing voor dissociatie van enkele cellen; meerdere leveranciers; protocol 1.1.2 "enzymatische celdissociatieoplossing” 
Research Cryostat Leica CM3050 SLeica biosystemsCM3050 SMeerdere leveranciers
SB431542Selleckchem.comS1067Meerdere leveranciers
Spinnerkolf 250 mLIBS Integra Bioscience182026
SucroseAppliChemA4734, 1000Meerdere leveranciers
Superfrost ultra plus microscoopglazenThermo scientific, USJ3800AMNZGlazetten moeten worden gelabeld met een "+" en positief geladen
Supplement 1Gibco, US17502048N-2 supplement (100x)
Supplement 2 zonder Vitamine AGibco, US12587010B-27 supplement (50x), minus vitamine A; meerdere leveranciers
Tissue-Tek CryomoldSakura, NL4565Meerdere leveranciers
Tissue-Tek O.C.T. compoundSakura, NL4583Meerdere leveranciers
Triton X-100AppliChemA1388,0500Meerdere leveranciers
TUJ1Sigma-Aldrich, UST2200β-Tubulin III (konijn polyklonaal)
TUNEL-assayPromega, USG3250DeadEnd Fluorometrisch TUNEL-systeem; meerdere leveranciers
Tween 20 voor moleculaire biologieAppliChemA4974,0500Meerdere leveranciers
waterdichte folieBEMIS company, inc.PM996Parafilm “M”; meerdere leveranciers
Y-27632 Selleckchem.comS1049ROCK-remmer (Y-27632 2HCL); meerdere leveranciers
β-mercaptoethanolGibco, US313500102-mercaptoethanol (50 mM); meerdere leveranciers

Referenties

  1. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
  2. Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
  3. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  4. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
  5. Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
  6. Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
  7. Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
  8. Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986(2014).
  9. Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
  10. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
  11. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
  12. Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
  13. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
  14. Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
  15. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  16. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
  17. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  19. Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
  20. Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307(2015).
  21. Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646(2014).
  22. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
  23. Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
  24. Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
  25. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
  26. Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
  27. Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
  28. Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
  29. Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
  30. Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
  31. Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759(2016).
  32. Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
  33. Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
  34. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
  35. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
  36. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
  37. Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
  38. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

iPSC differentiatiemodellering van microcefalieanalyse van neurale progenitorcellenventriculaire zone imagingcryosectieprotocolspinner flescultuurimmunofluorescentiekleuringpati ntafgeleide iPSC s
Genereren van iPSC afgeleide Human Brain Organoids naar Early Neurodevelopmental Disorders Model
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.