Summary

Genereren van iPSC afgeleide Human Brain Organoids naar Early Neurodevelopmental Disorders Model

Published: April 14, 2017
doi:

Summary

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Abstract

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.

This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, “Brains in a dish,” that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.

To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Introduction

Menselijke neurologische stoornissen, zoals microcefalie, kan slechts slecht worden bestudeerd in diermodellen vanwege het feit dat de menselijke hersenen een verlengd corticale oppervlak, een unieke eigenschap die verschilt van niet-humane dieren.

Dit aspect maakt de ontwikkeling van menselijke hersenen een complex proces dat niet voldoende kan worden onderzocht in een 2D in vitro celcultuur. Opkomst 3D kweektechnieken kan de vorming van weefselachtige organoids van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). De in vitro differentiatie van pluripotente stamcellen in een 3D suspensiekweek maakt de vorming van verschillende celtypen tijdig en regiospecifieke wijze, hetgeen leidt tot een georganiseerde, gelaagd weefsel 1, 2, 3. Met dank aan laboratoria die 3D-cultuur technologieën pionier en gedemystificeerd de complexiteit van de formatie orgel, uitgaande van stamcellen,ontwikkelden we een robuuste werkwijze voor het genereren hersenen organoids vroege gebeurtenissen van ontwikkeling van menselijke hersenen af te bakenen en microcefalie model in vitro 1, 2, 3. Het is opmerkelijk dat we pasten de originele methode ontwikkeld door Lancaster et al. cerebrale organoids 1 genereren. Deze werkwijze werd gemodificeerd volgens onze experimentele eisen.

Het doel van een studie van Gabriel et al. was om de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurale stamcellen onderhoud te analyseren tijdens de ontwikkeling van de hersenen. Om dit te doen, werd een mechanistische onderzoek uitgevoerd door het analyseren van neurale progenitorcellen (NPC) in 3D hersenen organoids afgeleid van een microcefalie patiënt 4. Deze patiënt had een mutatie in CPAP, een geconserveerd centrosomal proteïne noodzakelijk voor centrosome biogenese 5. Een algemeen aanvaard hypostelling is dat microcefalie is het gevolg van een afname van het NPC pool en dit zou te wijten ofwel celdood of differentiatie voortijdige 1, 6, 7, 8, 9.

Door het analyseren van de ventriculaire zone (VZS) van microcefalie hersenen organoids werd aangetoond dat een aanzienlijk aantal NPC ondergaan asymmetrische celdeling, anders dan de hersenen organoids verkregen uit een gezonde donor 4. Uitgebreide microscopische en biochemische analyses van microcefalie hersenen organoids onthulde een onverwachte rol voor de CPAP in tijdig cilia demontage 4. Specifiek wordt gemuteerd CPAP gekoppeld aan achtergebleven cilium demontage en vertraagde celcyclus opnieuw binnenkomen, wat leidt tot voortijdige differentiatie van NPC 4. Deze resultaten suggereren een rol voor cilia in microcefalie en thEIR betrokkenheid tijdens de neurogenese en de omvang van de hersenen controle 10.

Het eerste deel van dit protocol is een beschrijving van een drietrapsmethode homogene hersenen organoids genereren. Zoals eerder vermeld, is de oorspronkelijke Lancaster protocol aangepast en gemodificeerd om ons doel passen 1. Eerst, menselijke iPSCs gekweekt in een gedefinieerde toestand als feeder-on Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix. Deze stap vermijdt de variaties van feeder-afhankelijke pluripotente stamcel cultures. In dit protocol, het induceren van neuronale differentiatie onder vorming neurale epitheel begint direct vanuit iPSCs. Sla de embryoiden lichaam (EB) vormingsstap, het neurale differentiatie verloopt in een gecontroleerde en gerichte wijze. Deze aanpak beperkt de spontane en ongestuurde vorming van andere kiemcellen lagen, zoals mesoderm en endoderm. Door toepassing van dit protocol kunnen neurosferen die neurale rozetten worden geoogst op dag 5 EHS matrix inbedden en stationaire suspensiekweek. De organoïde medium dat voor de derde stap van ons protocol is aangevuld met dorsomorphin en SB431542. Dorsomorphin is een klein molecuul remmer van botmorfogeenproteïne (BMP) en SB431542 remt de TGF / activine / nodale signaalroute. De combinatie van deze factoren kunnen neurale differentiatie efficiënter dan retinezuur alleen 11, 12, 13, 14 te bevorderen.

In totaal hebben deze modificaties maken de reproduceerbare vorming van hersenen organoids met minimale verschillen tussen organoids. Belangrijk is dat deze werkwijze toegepast op robuuste genereren microcefalie hersenen organoids van patiënt iPSCs die mutaties dragen in genen die centrosomes en celcyclus dynamica beïnvloeden.

Het tweede deel van dit protocol geeft instructies aan br voorbereidingain organoids voor de analyse en interpretatie van de cellulaire defecten in microcefalie. Dit omvat fixatie, cryosectioning, immunofluorescentie kleuring en confocale microscopische analyse. Dit protocol zal de lezer te voorzien van een gedetailleerde beschrijving van de verwachte resultaten en onder begeleiding voor interpretatie.

Protocol

1. Generatie van Brain Organoids (23 dagen) Initiatie van neuroectoderm (5 dagen) OPMERKING: De volgende punten moeten worden overwogen vóór het begin van differentiatie. Herprogrammering methode (lentiviral-, sendai-virus, episomal- of microRNA-gebaseerde etc.) aan humane iPSCs verkrijgen idealiter hetzelfde voor alle patiënten en controle iPSC lijnen. Verschillende herprogrammering kits en instructies op basis van gepubliceerde protocollen beschikbaar <s…

Representative Results

Het genereren van hersenen organoids vereist ten minste drie weken continue kweek (Figuur 1A). Om reproduceerbare resultaten te bereiken, raden wij aan dat de onderzoeker documenteert elke stap en, belangrijker nog, vermijdt eventuele wijzigingen met betrekking tot medium componenten, tijdstippen, en de behandeling cel. Hier geven we een samenvatting van hoe om te evalueren of kritische mijlpalen zijn bereikt om organoids van voldoende kwaliteit aan het eind van het expe…

Discussion

MCPH is een complexe menselijke neurologische aandoening die niet in dierlijke modellen kunnen worden gerecapituleerd in vivo of in eenvoudige menselijke celculturen benaderingen in vitro. De klinische manifestatie van MCPH begint te verschijnen tijdens het eerste trimester, toen de eerste neurogenese begint. Zo 3D hersenen organoids vertegenwoordigen een betrouwbaar experimenteel systeem om MCPH ontwikkelingsmodel. Bovendien 3D menselijke hersenen organoids een ideale benadering omdat i) zij maken de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de Fritz Thyssen Foundation (Az.10.14.2.152). We zijn dankbaar voor het weefsel inbedding faciliteit en de microscoop kernfaciliteit van CMMC. We zijn dankbaar voor de besprekingen en technische steun van de leden van het Laboratorium voor centrosome en cytoskelet Biology. Wij danken Li Ming Gooi voor het nalezen van het manuscript.

Materials

Anti-mouse 488 Invitrogen A-11001 Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647 Invitrogen A-21245 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13b proteintech 17711-1-AP ARL13B rabbit polyclonal antibody 
CELLSPIN system IBS Integra Bioscience 183001
DAPI Sigma-Aldrich, US 32670 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12 Gibco, US 31331093 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 
Dorsomorphin Sigma-Aldrich, US P5499 Compound C; multiple suppliers
Embedding medium AppliChem A9011, 0100 Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix Corning 354277 Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin  Sigma-Aldrich, US G7765-250ML Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4°C
Glycine AppliChem A1067,1000 Glycine for molecular biology; multiple suppliers 
Inoculation loop with needle, disposable (1 µl) Sigma Aldrich, US BR452201-1000EA multiple suppliers 
Insulin Sigma-Aldrich, US I3536-100MG multiple suppliers
L-glutamine Gibco, US 25030081 L-glutamine (200 mM)
Medium A Stem cell technologies #05850 mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium B Stem cell technologies #05835 Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium C Gibco, US 21103049 Neural Basal Medium
MEM Gibco, US 11140035 MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza, Switzerland #LT07-218 Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
Nestin Novus biologicals NBP1-92717 Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA) AppliChem A3813, 0500 4% in PBS, store solution at -20°C; caution: wear skin and eye protection and work under hood 
PBS tablets Gibco, US 18912014 See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) Gibco, US 15140122 Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL) Sigma-Aldrich, US P8920-100ML Multiple suppliers
pVim MBL D076-3S Phospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A  Stem cell technologies # 05872 Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B  Sigma-Aldrich, US A6964-100ML Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” 
Research Cryostat Leica CM3050 S Leica biosystems CM3050 S Multiple suppliers
SB431542 Selleckchem.com S1067 Multiple suppliers
Spinner flask 250 ml IBS Integra Bioscience 182026
Sucrose AppliChem A4734, 1000 Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slides Thermo scientific, US J3800AMNZ Slides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1 Gibco, US 17502048 N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin A Gibco, US 12587010 B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek Cryomold Sakura, NL 4565 Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura, NL 4583 Multiple suppliers
Triton X-100 AppliChem A1388,0500 Multiple suppliers multiple suppliers
TUJ1 Sigma-Aldrich, US T2200 β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assay Promega, US G3250 DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biology AppliChem A4974,0500 Multiple suppliers
waterproof sheet BEMIS company, inc. PM996 Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632  Selleckchem.com S1049 ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanol Gibco, US 31350010 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers

References

  1. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
  2. Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
  3. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  4. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
  5. Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
  6. Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
  7. Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome?. Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
  8. Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
  9. Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
  10. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
  11. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
  12. Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
  13. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
  14. Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
  15. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  16. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
  17. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  19. Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
  20. Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
  21. Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
  22. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
  23. Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
  24. Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
  25. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
  26. Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
  27. Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
  28. Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
  29. Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
  30. Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
  31. Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
  32. Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
  33. Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
  34. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
  35. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
  36. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
  37. Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
  38. D’Avanzo, C., et al. Alzheimer’s in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).

Play Video

Cite This Article
Gabriel, E., Gopalakrishnan, J. Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (122), e55372, doi:10.3791/55372 (2017).

View Video