של הצפרדע האמריקנית (רנא catesbeiana) sacculus מתיר בדיקה ישירה של פיזיולוגית שיער תאים. כאן לנתיחה וההכנה של sacculus הצפרדע ללימודי biophysical מתוארת. אנחנו מראים ניסויי נציג מתאי שיער אלה, לרבות חישוב יחס כוח-העקירה של צרור והמדידה של התנועה המאולצת שלה.
המחקר של השמיעה ושיווי המשקל נשען על תובנות שנשאבו מחקרים biophysical של מערכות מודל. מודל אחד כזה, את sacculus של הצפרדע האמריקנית, הפך תווך של מחקר שמיעתי שיווי משקל. מחקרים של האיבר הזה חשפו כיצד חושי בתאי שיער יכול לזהות אותות פעילים מהסביבה. בגלל המחקרים הללו, עכשיו אנחנו מבינים טוב יותר את gating ולוקליזציה מכני של ערוצי התמרה של תאים שיער, תפקידו של הסידן הסתגלות מכני, ואת הזהות של זרמים תא השיער. איבר נגישות גבוהה זו ממשיך לספק תובנה פעילותם של תאי שיער. כאן אנו מתארים את ההכנה של sacculus הצפרדע ללימודי biophysical על תאי השיער שלה. אנו כוללים את ההליך לנתיחה המלא לספק פרוטוקולים ספציפיים עבור הכנת sacculus בהקשרים ספציפיים. אנחנו גם כוללים תוצאות נציג השימוש בתכשיר, לרבות חישוביחס עקירה בכוח מיידי של שיער צרור ומדידה של תנודה ספונטנית של אגד.
אברי acousticolateralis של יונקים בעלי ארכיטקטורה מורכבת שקר בתוך נישה אנטומיים שיכולים להיות קשים לגישה. לדוגמא, השבלול היונק מורכב מבוך התפתל והוא מוטבע בתוך העצם הטמפורלית העבה. בידוד של השבלול לעתים קרובות גורם ניזק מכני התא החושי שוכב בתוכו ולכן הוכיח להיות משימה קשה 1. חוקרי מערכת העצבים ובכך הפכו מודל מערכות אשר יותר חילוץ בקלות מן הקודשים של האוזן.
אחת ממערכות מודל אלה, sacculus של צפרדע האמריקאי (רנא catesbeiana), במשך עשרות שנים הניב תובנות להכליל לתוך הפונקציה של מערכת השמיעה ואת שיווי המשקל. Sacculus הוא איבר מעורב פונקציה עם תפקידים חושיים בשתי שמיעה בתדירות נמוכה ותחושה סייסמיים. התאים החושיים של sacculus הם תאי השיער שלה, מתמרים מיוחדים שממירים אנרגיה מכאניתלאותות חשמליים בתוך האיברים השמיעתיים הווסטיבולארית. הקרנה מפני שטח הפסגה של כל תא שיער הנה למעשה אגודת שיער mechanosensitive שכוללת ציצת מדורגים של microvilli המוגדל שנקרא stereocilia. העצות של stereocilia הסמוך הם מחוברים על ידי חלבוני filamentous טיפ-מקשרים מכאני תעלות יוני שער בתגובה לגירויים מכאניים 2, 3. למרות איברים שמיעתיים שיווי משקל להגיב לסוגים שונים של גירויים, הם חולקים מנגנון זיהוי משותף. אחידות זו היא תחילתה של תובנות רבות שנרכשו לתוך mechanotransduction שיער תאים באמצעות מחקרים של sacculus לצפרדע. לדוגמא, התהליך הפעיל של שיער התא נחקר בהרחבת האיבר הזה 4, 5, 6, 7, ואת צרור השיער מעסיק בתהליך רב-אנרגיה כדי לייצר מכניםעֲבוֹדָה. לא זו בלבד שהיא הוכחה כי תאי שיער ליצור עבודה פעילה 6, אבל מנגנונים נפרדים שבבסיס התהליך הפעיל מאפייני הכוונון של תא שיער כבר חשפו באמצעות מחקרים של צפרדע acousticolateralis איברים. אלה כוללים תנועתיות שיער חלק מחבילה פעילה 8 ותא שיער חשמלי תהודה 9, 10, 11 sacculus סלקטיביות תדירות הסינפסה הסרט של תא השיער 12 ב פטמית אמפיבי.
של sacculus הצפרדע מושך מדעני מוח חושיים מסיבות רבות. בניגוד השבלול היונק, האיבר הזה נמצא בתוך הקפסולה otic נגיש בקלות. שנית, בתאי השיער בתוך האיבר הזה יכול להישאר בריאים במשך כמה שעות תחת תנאים מתאימים 13, 14. זה מאפשר experimentatיון על תאים אלה על לוחות זמנים ארוכים יחסית לעמיתיהם היונקים שלהם. שלישית, האיבר נושא עקמומיות קטנה, המתיר מניפולציה קלה. רביעית, כל איבר מורכב שיער אלף תאים או יותר 15, מתן גם תפוקה גבוהות סבירות גבוהה איתור של סט מתאים של תאי שיער עבור בניסוי נתון. לבסוף, של sacculus הצפרדע היא דמיינה בקלות בשל הרזון של האיבר הזה וגודל גדול של תאי השיער שלה.
מאפיינים אלה מספקים גמישות רבה לחקר תאי חושי בתוך של sacculus לצפרדע. בהתאם השאלה שעל הפרק, אחד ההכנות ניסיוני כמה ניתן המתקבל sacculus. הפשוט שבהם הוא הכנת חד קאמרית. כאן sacculus היא משותקת בתא מלא perilymph מלאכותית, מלוח נתרן עשיר גבוה סידן. הכנה זו מאפשרת הלימוד של זרמי תא שיער ומכניקה צרור שיער בסיסית. תצורה שנייה, הכנה שני הקאמרי, יכולה לשמש כדי לחקור תנועות צרורות שיער ספונטניות. כאן בצד הפסגה של תאי השיער חשוף מלוחים אשלגן-עשיר בסידן עניים כינה endolymph מלאכותית, בעוד הצד basolateral טובל perilymph מלאכותית. תאים אלה שני לחקות את הסדר in vivo של Salines ולספק סביבה המאפשרת צרורות שיער להתנדנד באופן ספונטני.
אנו מתארים במאמר זה ההכנה של sacculus הצפרדע למחקר ביו-תאי השיער החושיים שלה. אנחנו ראשונים לספק תיאור מפורט של הבידוד של האיבר הזה מהאוזן הפנימית של הצפרדע. לאחר מכן, אנו מתארים הם אחד ו הכנות ניסיון שני הקאמרי וכוללים תוצאות נציג עבור כל תצורה.
בתוך של sacculus הצפרדע לשקר כמה אלף תאי שיער חושיים נגישים. כאן אנו מדגימים חילוץ והכנה sacculus להקלטות אחד והשני קאמרית. ההכנות שני אלה מאפשרים בשני המחקרים micromechanical ו אלקטרו של תאי השיער חבילות הקשורים בהם. מכיוון הרקמה יכולה לשרוד במשך כמה שעות עם החלפה תכופה של תמיסת מלח מחומצן, ניסויים יכולים להימשך תקופות ארוכות. תאי שיער בהכנות אלה בדרך כלל נשארים קיימא עבור הקלטה microelectrode עד 6 שעות לאחר הניתוח, בעוד צרורות שיער להתנדנד באופן ספונטני עד 24 שעות לאחר החילוץ.
מיצוי הרכבה מוצלח של sacculus צירים על surmounting כמה אתגרים משותפים. ראשית, מגע ישיר עם למשטח הפסגה של המקולה saccular יש להימנע לאורך כל ההליך הכנה. העצב saccular מספק ידית נוחה manipu בטוחאוכלוסייה של sacculus. לאחר משוחררים משאר האיברים הפנימיים-האוזן, sacculus יועברו בעזרת פיפטה גדול נשא תוך שמירה שקוע בנוזל, כדי למנוע נזק מכני האפיתל חושית שלה. הסרת otoconia מפני השטח מקולרי חייב להסתיים ללא נזק מכני לתאי שיער. מכיוון otoconia לשקר ישירות על גבי המקולה, בתאי השיער עלולים להיפגע על ידי מגע מקרי בין כלי לנתיחה הממברנה otolithic תוך הסרת otoconia. כדי למנוע ניזק, אנו ממליצים שההמסה הדביקה של otoconia שתתקיים בבאתר רחוק המקולה והוציאה כגוש אחד. זה ימנע פיצול של מסת otoconial לאשכולות רבים, שכל אחד מהם יהיה חילוץ בנפרד. אם אשכולות קטנים של otoconia להישאר הם יכולים להסיר עם לחץ נוזל עדין נמסר על ידי פיפטה פסטר. אתגר אחרון כולל היווצרות חותמת חזק בין כיכר הרכבת sacculus והאלומיניום בהכנת שתי קאמרית. העסקה מרובעת עם נקב קטן מספיק כדי לאפשר חפיפה של כ -100 מיקרומטר בין sacculus ואת היתרי אלומיניום שמסביב אטימה מלאה של הרקמה. הדבק צריך להיות מובא במגע עם כ 100 מיקרומטר של רקמות saccular מסביב של המקולה כדי ליצור חותם חזק.
ריכוז Ca חינם 2+ הוא שיקול חשוב בחקר תאי שיער. Ca 2 + המסדיר הוא הסתגלות מהירה ואיטית, ובכך בקביעת קינטיקה של מנגנון mechanotransduction ואת המאפיינים של תופעות פעילה בתהליך של צרור השיער, כולל תנועת 8 צרור ספונטני, 23. סידן Endolymphatic in vivo נמצא ב 250 מיקרומטר, ולכן קינטיקה הרלוונטית ביותר מהבחינה הפיזיולוגית מוערכת בריכוז זה (Maunsell JHR, ר 'ג' ייקובס, ו AJ Hudspeth. Unpublisתצפיות הד 16). עם זאת, קלטות microelectrode מתאי שיער דורשות ריכוז סידן חיצוני עולה על 2 מ"מ לאיטום תקין של הממברנה התאית סביב microelectrode. לכן חשוב להשתמש מלוחים גבוה סידן לניסויים אלה. לבסוף, אחד מומלץ לחקור את ההשפעות של סידן חיצוני על mechanotransduction באמצעות מגוון של ריכוזי סידן. במקרים אלה, חשוב לזכור כי ריכוזי סידן מתחת ל -1 מיקרומטר בדרך כלל להוביל לקרע טיפ-link ואובדן בלתי הפיך של תמרה 28.
שתי ההכנות ניסיון המתואר כאן מאפשרות מגוון של מדידות biophysical על תאי שיער. עם זאת, מדידות נוספות יכולות להתבצע עם שינויים קלים כדי ההכנות הללו. בהכנת saccular המקופלת, חבילות שיער הם דמיינו רוחביים. הדמיה בתנועה שיער חלק מחבילה מנקודת תצפית זו מגלה mot קוהרנטיתיון של שני stereocilia הקצר והגבוה 29. הנה המקולה saccular מופרדת ראשונה מרקמות הבסיס שלה ובהמשך מקופל לאורך הציר המוגדר על ידי עצב saccular כך צרורות שיער פן כלפי חוץ הם דמיינו רוחביים בקפל. מודיפיקציה שני, דיסוציאציה שיער תאים, מאפשר המחקר הן של הצרור של תא שיער סומה שלה. תאי שיער הם ניתקים מכאניים על גבי זכוכית נושאת עבור הקלטת הדמית אלקטרו 30. לבסוף, בתאי השיער ניתן הנמתח מן האפיתל על ידי ביצוע פרוטוקול דיסוציאציה דומה אך ללא הצעד ניתוק מכני. תוצאות טיפול זה בתאי השיער בהדרגה extrude מתוך האפיתל, מתן גישה basolateral עבור הקלטות אלקטרו תוך מזעור נזק מכני. תכשירים אלה ושינויים רבים שלהם להפגין את הרבגוניות של הצפרדע sacculus כמערכת מודל עבור biophysicalמחקר של תאי שיער חושיים.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to acknowledge Dr. A. J. Hudspeth for funding and expertise in developing the preparations described in this paper. We also wish to thank Brian Fabella for creating and maintaining much of the custom equipment and software used in this protocol.
J. B. A. is supported by grant F30DC014215, J. D. S. is supported by grant F30DC013468, and both J. B. A. and J. D. S. are supported by grant T32GM07739 from the National Institutes of Health.
Common to both preparations | |||
Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
35 mm Petri dish (x2-3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For one-chamber preparation | |||
Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For two-chamber preparation | |||
Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
Mounting block | Supplementary file 3 | ||
Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline components | |||
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Parts lists for home-made equipment | |||
Solenoid puller | |||
Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Magnetic pins | |||
Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Open-top magnetic chamber | |||
Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |