بروتوكول لتوصيف التغيرات المورفولوجية<em> كلوستريديوم ديفيسيل</em> في الاستجابة للعلاج بالمضادات الحيوية
Summary
Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.
Abstract
تقييم عمل المضادات الحيوية مع تطوير العقاقير الجديدة الموجهة نحو البكتيريا اللاهوائية أمر صعب ومطالب من الناحية الفنية. للحصول على نظرة ثاقبة وزارة الزراعة ممكن، والتغيرات المورفولوجية المرتبطة التعرض للمضادات الحيوية يمكن تصور باستخدام المجهر الإلكتروني المسح (سيم). دمج التصوير سيم مع منحنيات قتل التقليدية قد تحسن رؤيتنا في العمل المخدرات والمضي قدما في عملية تطوير المخدرات. لاختبار هذه الفرضية، وقتل منحنيات ودراسات سيم أجريت باستخدام المخدرات مع وزارة الزراعة المعروفة ولكن مختلفة (فانكومايسين وميترونيدازول). خلايا C. صعب (R20291) نمت مع أو بدون وجود المضادات الحيوية لمدة تصل إلى 48 ساعة. على مدى فترة 48 ساعة، تم جمع الخلايا في نقاط زمنية متعددة لتحديد فعالية المضادات الحيوية والتصوير على سيم. وتمشيا مع التقارير السابقة، كان فانكومايسين وميترونيدازول نشاطا كبيرا للجراثيم بعد 24 ساعة من العلاج على النحو الذي تقاسه وحدة تشكيل مستعمرة (كفو) كونتينغ. باستخدام التصوير سيم، وجدنا أن ميترونيدازول له آثار كبيرة على طول الخلية (> 50٪ تخفيض في طول الخلية لكل المضادات الحيوية؛ P <0.05) مقارنة مع الضوابط والفانكومايسين. في حين لم يتم توثيق الاستجابة المظهري للعلاج من تعاطي المخدرات سابقا بهذه الطريقة، فإنها تتفق مع وزارة الزراعة المخدرات التي تبين تنوع وموثوقية التصوير والقياسات وتطبيق هذه التقنية للمركبات التجريبية الأخرى.
Introduction
كلوستريديوم ديفيسيل عبارة عن جرثومية إيجابية تشكل البكتريا التي تسبب الجراثيم، مما تسبب في حوالي 500،000 إصابة سنويا في الولايات المتحدة، ويعتبر هذا المرض ممرضا عاجلا على مستوى التهديد من قبل مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها، وهو أعلى مستوى من المخاطر. 1 شهد العقد الماضي تطورا كبيرا في العقاقير المضادة للميكروبات مع النشاط ضد C. صعب . 2 ، 3 في المختبر الدراسات هي عنصر ضروري من عملية تطوير المخدرات. 4 تقليديا، في المختبر وقابلية الوقت وقتل الدراسات تستخدم للتحقق من صحة الحيوان في المستقبل وغيرها من الدراسات في الجسم الحي .
في حين أن هذه الأساليب تخدم دورا هاما لتقييم عمل القتل، فإنها لا تعبر عن استجابة الخلايا الظاهرية للعلاج الدوائي. من خلال دمج المسح المجهري الإلكتروني (سيم) مع القياسيهد قتل الدراسات الحركية، توصيف أكثر دقة من المضادات الحيوية الآثار المباشرة هو ممكن. 5 ، 6 ، 7 هنا، نقدم طريقة حيث سيم يستخدم كوسيلة للتعرف على فعالية العلاج بالمضادات الحيوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكان الهدف من الدراسة الحالية لخلق طريقة عالية الإنتاجية لعزل C. صعب واختبار الحساسية للمضادات الحيوية باستخدام المجهر الإلكتروني المسح (سيم) كوسيلة لتوصيف أكثر دقة من العمل الدوائي للمضادات الحيوية. باستخدام البروتوكولات المبينة هنا، أثبتنا أن التصوير استجاب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These experiments have been supported by research grants from Merck and Co. and Summit, PLC.
Materials
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75x25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
