Absolute kwantificering van Aß_1-42 In CSF met behulp van een Massaspectrometrische Reference Measurement Procedure

Summary

A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ_1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.

An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ_1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Introduction

Ziekte van Alzheimer (AD) is de meest voorkomende vorm van dementie en treft ongeveer 35 miljoen mensen wereldwijd ^1. De neuropathologische kenmerken van de ziekte algemeen aangenomen in de kern van de pathogenese van AD te liggen zijn intracellulaire tangles van hypergefosforyleerd tau-eiwit ² en extracellulaire plaques bestaande uit geaggregeerde amyloid-beta (Aß) peptiden ^3. In lijn hiermee heeft de beoordeling van plaque pathologie in vivo door biomarkers onlangs opgenomen in het onderzoek diagnostische criteria voor AD ^4. Voor CSF metingen van AB _1-42, verschillende immunoassays zijn beschikbaar en worden gebruikt in vele klinische laboratoria ^5. De concentratie van Ap _1-42 in CSF is in AD patiënten ongeveer 50% lager dan in het cognitief normale ouderen, als gevolg van de afzetting van het peptide in plaques in de brain ^{6, 7.}

Deze biomarkers zijn voornamelijk geanalyseerd met immunoassays (bijvoorbeeld op antilichaam gebaseerde technieken), maar deze assays worden beïnvloed door matrixeffecten ^8. Het gebruik van immunoassays op verschillende technologische platforms en het gebrek aan standaardisatie assay ^{9, 10} maakt de invoering van globale cut-off concentraties moeilijk ^{11, 12.} Een analytisch gevalideerd RMP zou de uniforme kalibratie van verschillende assay platforms toe te staan, idealiter resulteert in een betere vergelijkbaarheid tussen de analytische platforms en in een betere controle van de factoren die bijdragen aan de totale meting variabiliteit.

De absolute kwantificering van Aß _1-42 met behulp van de ontwikkelde LC-MS / MS methode overwint veel van de kwesties in verband met antilichamen gebaseerde techniques. De methode, vermeld als een RMP door het Gemengd Comité voor Traceerbaarheid in Laboratory Medicine (JCTLM databank identificatienummer C11RMP9), zullen worden gebruikt om de absolute concentratie van Aß _1-42 te bepalen in een Certified Reference Material (CRM) te harmoniseren CSF AB _{1 -42} metingen over technieken en analyse-platforms. De beschreven workflow moet relevant zijn voor de ontwikkeling van kandidaat referentiemethoden voor peptiden en eiwitten in andere gebieden van de geneeskunde.

Protocol

Opmerking: Dit protocol vereist aliquots van ten minste 50 uL, met een concentratie van 50 ug / ml voor elk Aß peptide, als uitgangsmateriaal. De Aß peptiden worden opgelost in 20% acetonitril (ACN) en 4% geconcentreerde ammonia oplossing in gedeïoniseerd water (v / v) en bewaard bij 80 ° C. Let op: Zie tabel 1 voor informatie over veiligheid. 1. Bereiding van de oplossingen Bereid 100 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammonia oplos…

Representative Results

De plaat opstelling in figuur 1 wordt gebruikt voor een volledige plaat van monsters. Als er minder onbekende monsters moeten worden geanalyseerd, de tweede kalibrator, RF, en QC sets moet worden geplaatst na de eerste helft van de onbekende monsters. Zoals blijkt uit figuur 2, de kalibrators dicht bij de regressielijn met lage standaarddeviaties. Deze methode heeft een lager kwantificering va…

Discussion

Voor de beschreven werkwijze, in plaats van een surrogaat matrix gebruikten we de surrogaat analyt benadering ^{13, 14, 15, 16,} die ijking in menselijke CSF maakt. Het surrogaat analyt benadering omvat twee verschillende isotopisch gelabelde standaards. On ⁽¹⁵ NAβ ₁₄₂₎ wordt gebruikt om de kalibratiekromme in menselijk CSF genereren, terwijl andere ⁽¹³ CAβ <sub…

Materials

Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	022431102
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom	Micronic	MPW32071BC3	Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates.
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes	Micronic	MP53026	Caps for Micronic tubes.
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded	Micronic	MPW51015BC3	Holder for Micronic tubes.
Biohit Optifit tips 1.2 mL	Sartorius	791210	Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well.
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate	Waters	186001830BA
Waters Plate manifold reservoir tray	Waters	WAT058942
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates	Waters	186001831
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
Guanidine Hydrochloride, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler.
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)	Dionex	066640
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated	Sigma-Aldrich	B6917
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1102-2
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1106-2
Microplate shakers, TiMix 2	Edmund Bühler	6110 000