A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.
Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.
An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ1-42 between 150-4,000 pg/mL.
Alzheimers sjukdom (AD) är den vanligaste formen av demens och drabbar cirka 35 miljoner människor i världen en. De neuropatologiska kännetecknen för sjukdomen allmänt anses ligga i centrum av AD patogenes är intracellulära neurofibrillära nystan av hyperfosforylerat tau-protein 2 och extracellulära plack som består av aggregerade amyloid-beta (Ap) peptider 3. I linje med detta har bedömningen av plack patologi in vivo av biomarkörer nyligen förts upp på forsknings diagnostiska kriterierna för AD 4. För CSF mätningar av Ap 1-42, flera immunologiska metoder tillgängliga och används i många kliniska laboratorier 5. Koncentrationen av A-beta 1-42 i CSF är cirka 50% lägre hos AD-patienter än i den kognitivt normala äldre, vilket återspeglar den avsättning av peptiden i plack i brain 6, 7.
Dessa biomarkörer främst analyseras med hjälp av immun (dvs. antikroppsbaserade tekniker), men dessa analyser kan påverkas av matriseffekter 8. Användningen av immun på olika teknikplattformar och bristen på analys standardisering 9, 10 gör införandet av globala cut-off halter svåra 11, 12. En analytiskt validerade RMP skulle tillåta en enhetlig kalibrering av olika analys plattformar, helst resulterar i bättre jämförbarhet mellan analytiska plattformar och i bättre kontroll av faktorer som bidrar till den totala variationen mätningen.
Den absoluta kvantifiering av Ap 1-42 genom att använda den utvecklade LC-MS / MS-metoden övervinner många av de frågor som är förknippade med antikroppsbaserad tekniques. Metoden, listad som en RMP av gemensamma kommittén för spårbarhet i laboratoriemedicin (JCTLM databas identifikationsnummer C11RMP9), kommer att användas för att bestämma den absoluta koncentrationen av Ap 1-42 i ett certifierat referensmaterial (CRM) för att harmonisera CSF Ap 1 -42 mätningar över och analys plattformar. Den beskrivna arbetsflöde bör vara av betydelse för utvecklingen av referens kandidat metoder för peptider och proteiner inom andra områden inom medicinen.
För den beskrivna metoden, istället för att använda ett surrogat matris använde vi surrogat analyt metod 13, 14, 15, 16, som gör det möjligt för kalibrering i human CSF. Surrogat analyt synsätt innebär två olika isotopiskt märkta standarder. On (15 NAβ 142) används för att generera kalibreringskurvan i human CSF, medan en annan (13 CAβ 142)…
The authors have nothing to disclose.
This work was performed on behalf of the International Federation of Clinical Chemistry Working Group on CSF Proteins, which has the following composition: Kaj Blennow (Chair) and Henrik Zetterberg, Gothenburg University, Sweden; Les Shaw and Magdalena Korecka, University of Philadelphia, PA, USA; Ingrid Zegers, Institute for Reference Materials and Measurements, Geel, Belgium; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Germany; and Rand Jenkins, PPD Bioanalytical Laboratory, Richmond, VA, USA; Randall Bateman, Washington University, MO, USA; and H Vanderstichele, Innogenetics NV, Ghent, Belgium. This work was also part of the Global Consortium for Biomarker Standardization CSF Reference Methods Working Group, which is led by Maria C. Carrillo, Ph.D., Senior Director, Medical & Scientific Relations, Alzheimer’s Association. The study was supported by The Swedish Research Council (grants #14002, #521-2011-4709, and #2013-2546); the Knut and Alice Wallenberg Foundation; Demensförbundet; and Emil and Wera Cornell’s, Aina Wallström and Mary-Ann Sjöblom’s, Gun and Bertil Stohne’s, Magnus Bergvall’s, and Gamla Tjänarinnor’s Foundations.
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |