Два алгоритма анализа изображений, «дрозофила НМС морфометрия» и «дрозофила НМС Бутон морфометрия» были созданы, чтобы автоматически количественно девять морфологических особенностей нервно – мышечное соединение Drosophila (НМС).
Синаптическая морфология плотно связана с синаптической эффективностью, и во многих случаях морфологических дефекты синапса в конечном счете, приводят к синаптической неисправности. Дрозофилы личиночное нервно – мышечное соединение (НМС), хорошо известная модель для глутаматэргических синапсов, было широко изучено в течение десятилетий. Выявление мутаций, вызывающих НМС морфологических дефектов показало репертуар генов, которые регулируют развитие синапсов и функцию. Многие из них были выявлены в крупномасштабных исследованиях, ориентированных на качественные подходы для выявления морфологических аномалий дрозофилы НМС. Недостаток качественного анализа является то, что многие тонкие игроки, способствующие НМС морфологии, вероятно, останется незамеченным. В то время как количественные анализы необходимы для выявления более тонких морфологических различий, такие анализы не часто выполняются, потому что они являются трудоемкими. Этот протокол описывает подробно два алгоритмов анализа изображений "дрозофила </em> НМС морфометрия»и„дрозофила НМС Бутон морфометрия“, доступная как Фиджи-совместимые макросы, для количественного, точного и объективного анализа морфометрического из Drosophila НМСА. Эта методика разработана для анализа NMJ терминалов immunolabeled с обычно используемыми маркерами Dlg-1 и . Brp Кроме того, его широкое применение для других маркеров, таких как HRP, СНТ и сыть представлен в этом протоколе макросы могут оценить девять морфологических НМС особенностей:. NMJ площадь, НМС по периметру, количество бутонов, НМС длины, НМС длинная ветвь длина, количество островов, число ветвей, число точек ветвления и числа активных зон в терминале NMJ.
Когнитивный расстройства , такие как умственная отсталость, расстройство спектра аутизма и шизофрения часто характеризуется аномальной синаптической функцией 1, 2, 3. Synapse морфология и функция плотно переплетены; морфологические дефекты могут привести к синаптическим неисправностям и, в противоположном направлении, аберрантная синаптическая передача будет влиять на синаптическое созревание и морфологию 4, 5, 6.
Ряд модельных организмов были использованы для того , чтобы лучше понять синапсов биологию и пролил свет на синаптические изменения влияют на функцию мозга в состоянии здоровья и болезни 7, 8, 9. Дрозофилы НМС является экстенсивно изучен и хорошо создан в естественных условиях модели для глутаматергических SYnapse биологии 10, 11. В последние десятилетия эта модель была использована для физиологических и генов-ориентированных исследований, а также для крупномасштабных генетических экранов, с целью выявления морфологических различий между НМС. В частности, передние генетические экраны определили многие важные регулирующие органы и механизмы , лежащие в основе развития синапсов и функции 12, 13, 14, 15, 16. Тем не менее, большинство из этих экранов полагались на визуальной оценке терминала морфологии НМС и качественного определения синаптических аномалий или полуколичественного озвучивания нескольких морфологических признаков. Как следствие, довольно тонкие синаптические морфологические отклонения, которые не являются очевидными для человеческого глаза легко пропустили. Для того, чтобы иметь возможность всесторонне выявить количественные различия,НМС должна быть точно оценены систематическим количественной оценки морфологических параметров, представляющих интерес. Измерительные функции NMJ вручную является трудоемким, особенно при наличии несколько NMJ особенности интереса, и / или при выполнении крупномасштабных генетических скринингов. Для того чтобы поддержать многопараметрический, высокие пропускную способность морфологического анализа и достижение объективной количественной оценки, два макросы «дрозофила НМС морфометрия» и «дрозофила НМС Бутон морфометрия» были разработаны 17. Оба макроса работает в с открытым исходным кодом для анализа изображений программного обеспечения Фиджи 18, и может количественно как конфокальные и неконфокальные изображения.
Меры «дрозофила НМС морфометрии» NMJ терминалы иммуноокрашиванию с постсинаптическим маркерным диском большого-1 (Dlg-1) или пресинаптической пероксидазой хрена (HRP), со-меченный активным зоной маркеров bruchpilot (BRP). Квантифицируется девять морфологического парамяTers (далее описано ниже): НМС площадь, НМС периметра, количество бутонов, НМС длина, НМС длинной длина ветви, число островов, число ветвей, число точек ветвления и числа активных зон в синаптическом терминале (Рисунок 1) , Хотя алгоритм для определения числа бутонов присутствует в этой макрокоманды, она не отвечает критериям точности 17. Для того, чтобы правильно оценить число бутонов, необходимо использовать «дрозофила НМС Бутон морфометрию» макро, который специально предназначен для количественного определения бутонов с использованием NMJ препаратов иммуноокрашиванию анти-Synaptotagmin (сыть) или анти-цистеин строки белком (CSP), и совместно immunolabeled с BRP. Макро «дрозофила НМС Бутон морфометрия» квантифицирует следующие параметры: число бутонов, NMJ площадь BOUTON, NMJ длину, NMJ наибольшей длину ветви, количество островов, число ветвей, число точек ветвления и количество активных ZOуказанные в другом месте (рисунок 2).
Макросы состоят из 3 суб-макросов: (I) , «Преобразование в стек» идентифицирует все доступные файлы изображений и создает Z-hyperstacks и максимальные проекции интенсивности обоих каналов. Как выход, этот макрос будет генерировать два новых файлов в синапсах под названием «stack_image_name» и «flatstack_image_name». II) , «Определение ROI» откроет все максимальные проекции изображения «flatstack_image_name» последовательно и представить их с просьбой , чтобы вручную определить область интереса (ROI) , в котором удельная синаптической терминал интерес присутствует. Это было реализовано , чтобы обеспечить исключение синапсов , соединяющиеся с прилегающими мышцами и / или другими типами синаптических окончаний (например, 1s) , которые могут присутствовать в изображениях 11. (III) «Анализ» применяется полностью автоматизированный анализ для всех областей изображений в пределах границ ROI. В видеВ результате этого шага, пользователь получит два новых файл: «results.txt», где будет аннотированными все численные измерения и «res_image_name.tif», где основная сегментация изображения, полученная с помощью макроса будет проиллюстрирована. Во время анализа изображений три структуры являются производными от каждого синаптического терминала: НМС контура, в NMJ скелета, а также числа BRP-позитивных активных зон. Контур НМСА используется для определения NMJ области и ее периметра и последующее разделение обеспечивает водосбор число бутонов. От скелета, пять NMJ функции выводится: общая NMJ длиной, сумма длины самой длинной непрерывной траектории, соединяющей любые две конечных точек (длинная длина ветви), количество несвязанных отсеков в НМС (упоминаются как «острова» ), количество ветвей, а число точек ветвления (одна точка ветвления соединяет три или более ветвей). Количество активных зон определяются в BRP-канале путем подсчетаBRP-положительные пятна. Аннотированный НМС контур (желтая линия), скелет НМСА (синяя линия), а число BRP-позитивных активных зон (обозначено белыми очаги) отображаются в виде изображения результатов и измерение параметров обрабатывается для апа (. TXT) выходной файл (рисунок 3).
Дрозофилы НМС морфометрия»и„дрозофила НМС Бутон морфометрия“были впервые описаны и широко подтверждены Nijhof и др. 17. Эта рукопись фокусируется на методологии анализ NMJ морфологии с использованием макросов„дрозофила НМС морфометрия“и„дрозофила НМС Бутон морфометрия“. тем не менее, до макро-анализов помощь, НМС и диссекция immunostainings должны быть выполнены. Эти важные шаги, и сочетание маркеров используется для иммуногистохимии должен быть пригоден для макро-анализа. Эти шаги кратко упомянуто в себе1 их этот протокол и направить пользователь на ссылки, описывающих подробно протоколы для выполнения этих процедур.
«Drosophila NMJ морфометрия» и «Drosophila NMJ Bouton морфометрия» является мощным инструментом для исследователей , заинтересованных в оценке синапсов морфологии. Ручная оценка НМС параметров является трудоемким; предполагается, что макрос будет сохранить опытного исследователя до 15 мин / НМС провел на сегментации изображения вручную. С одного до двух десятков синапсов оцененных в состояние или генотип, это быстро подводит итог значительного количества экономии времени, даже в небольших масштабах исследований. При выполнении больших экранов, коэффициент усиление с использованием высокого анализа пропускной способностью, по сравнению с ручной оценкой и количественным определением, может быть огромным. В дополнение к увеличению пропускной способности, макросы легко обеспечить объективный анализ; они исключают личные предубеждения, которые в противном случае требуют ослепленных экспериментов, а также межличностных различий, которые возникают, когда несколько исследователей участвуют в анализе. Наконец, макросы обеспечивают чувствительное и точное А.Нalysis особенностей НМС, что позволяет идентифицировать синаптических регуляторов, которые вызывают довольно тонкие, чем драматические NMJ дефектов и до сих пор оставались недооценивают глазом исследователя. Более подробная информация о процедурах проверки и алгоритмов , используемых в макросов найдены в публикации Nijhof и соавт. 17.
Функциональность макросов была подтверждена соответствующим образом измерить морфологические особенности дрозофилы NMJs на мышцах 4. Впоследствии было показано , что макросы также были пригодны для анализа синапсов на других мышцах в этом организме. Вполне вероятно , что макросы также могут быть использованы для измерения морфологических параметров NMJ с аналогичной структурой у других видов, в том числе других видов Drosophila и дальнейших насекомых. Даже NMJs очень далекие в эволюции, например, НМС мышей, показывают весьма похожую структурную конформацию 29, Макросы не были протестированы на НМС препаратов из других видов, но потенциальные пользователи рекомендуются проверить макросы для таких целей.
Это очень важно, чтобы пользователь исследует различные автоматические пороги и алгоритмы для определения / выбрать наиболее подходящие настройки для макро изображений. С помощью этих установок, точность примерно 95% достигается тогда, когда макро оценка была по сравнению с ручной оценкой. Настройка параметров макросов правильно сегмент 100% изображений может быть очень трудоемкой или даже невозможно процедурой. Таким образом, исключение из изображений не правильно сегментированных рекомендуется, если их количество составляет менее 5%. Очевидно, что если качество изображения является низким, макросы будут генерировать более высокие коэффициенты неудовлетворительных сегментаций изображения. Низкие качество изображения будет так же влиять на ручную оценку и поэтому не могут быть связаны с выполнением макросов. Тем не менее макросы достаточно надежны, как они были разработаны для изображенияы генерируется на высоком содержании микроскопа (автоматизированный флуоресцентный микроскоп , что позволяет визуализации большого числа образцов) 17.
Критическая точка является то, что пользователь визуально проверяет все изображения результата, генерируемые с помощью макросов. Это позволит обнаружить и исключить снимки с неудовлетворительной сегментацией. В разделе 6 настоящего протокола, пользователь руководствуется, как настроить параметры для правильной сегментации изображений при запуске субмакроблока «Анализ». Чтобы быстро ознакомиться с требованиями макросов и как настроить параметры макро папки под названием «Examples_adjusting настройки макроса» включен в макро хранилища https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Тринадцать вложенных папок, каждая из которых с примерами изображений, полученных на различных платформах микроскопа (высокое содержание / конфокальное / флуоресцентные микроскопы) и различные immunostainings, предоставляется. PDF-право «Примеры руководство» входит в тот жепапка, в которой параметры, необходимые для каждого примера представлены, наряду с текстовым документом, обеспечивающего ожидаемые результаты и результаты изображения.
Макросы были предназначены для обработки изображений, сохраненных в .tiff разделенных файлов, тем не менее, некоторые пользователи могли бы спасти свои изображения в другом формате. Следующий сайт https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 содержит папку с именем «Drosophila НМС» , где три файлы примеров (пример 1 – 3) и «Руководство Примеры» документ с подробными инструкциями , как импортировать изображения в макро если не хранится в виде отдельных файлов .tiff также можно найти в той же папке.
Вместе «Drosophila НМС морфометрия» и «Drosophila NMJ Bouton морфометрия» макросы количественно десять различной НМС функции: НМС площадь, НМС по периметру, количество бутонов, площадь Bouton НМСА, НМС длины, НМС длинной длины ветви, число ИслоНСР, число ветвей, число точек ветвления и количество активных зон. Это дает большое преимущество над до сих пор доступных инструментов , которые могут оценить только один или несколько синаптических функций 30, 31. Многопараметрический количественный анализ имеет большой потенциал для новых открытий, например, для идентификации новых регуляторов , которые контролируют один до многочисленных аспектов синаптической биологии. Она также обеспечивает требуемое разрешение, чтобы определить, что гены coregulate точно такую же или перекрывающийся NMJ функции и, таким образом, вероятно, будет действовать в общих молекулярных путях. И, наконец, открывает возможность исследовать , как различные синаптические параметры коррелируют друг с другом в ненарушенных условиях 17 и какие гены обеспечивают такие скоординированные морфометрические корреляции.
Взятые вместе, этот протокол показывает , как использовать два макроса «Drosophila NMJ морфометрия» и«Дрозофила НМС Бутон морфометрия», которые выполняют объективную и чувствительную количественную оценку десяти морфологических признаков NMJ в высокой пропускной образом.
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем , фондовый центр Вены Drosophila Resource Center и Блумингтон дрозофилы (NIH P40OD018537) для обеспечения штаммов дрозофилы. Мы благодарим Джек Франсен из микроскопических изображений Центра экспертной поддержки в визуализации. Это исследование было поддержано VIDI и ТОП грантов (917-96-346, 912-12-109) от Нидерландской организации научных исследований (NWO), два докторских стипендий DCN / Radboud University Medical Center, немецкой умственной отсталостью сети финансируется программой NGFN + немецкого Федерального министерства образования и научных исследований (BMBF) и FP7 крупномасштабных интегрированных сетевых Gencodys Европейского Союза (HEALTH-241995) в AS. В спонсорам не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
Immunostainings | Dilution | ||
Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
Material | Company | Catalog number | Comments |
Equipment | |||
Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
Zeiss Axio imager | |||
Computer | Mac or Pc | ||
Material | Company | Catalog number | Comments |
Software | |||
FIJI |