Se crearon dos algoritmos de análisis de imagen, "Drosophila NMJ morfometría" y "Drosophila NMJ Bouton morfometría", para cuantificar automáticamente nueve características morfológicas de la unión neuromuscular Drosophila (NMJ).
la morfología sináptica está estrechamente relacionada con la eficacia sináptica, y en muchos casos los defectos morfológicos sinapsis en última instancia conducir a un mal funcionamiento sináptico. La unión Drosophila larval neuromuscular (NMJ), un modelo bien establecido para las sinapsis glutamatérgicas, ha sido ampliamente estudiado por décadas. La identificación de las mutaciones que causan defectos morfológicos NMJ reveló un repertorio de genes que regulan el desarrollo de sinapsis y la función. Muchos de ellos fueron identificados en estudios a gran escala que se centraron en los enfoques cualitativos para detectar anomalías morfológicas de la Drosophila NMJ. Un inconveniente de los análisis cualitativos es que muchos jugadores sutiles que contribuyen a la morfología NMJ probable que pasan desapercibidos. Mientras que se requieren análisis cuantitativos para detectar las diferencias morfológicas más sutiles, tales análisis no son todavía comúnmente realizan porque son laboriosos. Este protocolo describe en detalle dos algoritmos de análisis de imagen "Drosophila </em> NMJ Morfometría" y 'Drosophila NMJ Bouton Morfometría', disponible como macros compatibles con Fiji, para el análisis morfométrico cuantitativo, precisa y objetiva de la Drosophila NMJ. Esta metodología se desarrolló para analizar terminales NMJ immunolabeled con los marcadores utilizados comúnmente Dlg-1 y . Brp Además, su aplicación más amplia a otros marcadores como Hrp, Csp y Syt se presenta en este protocolo Las macros son capaces de evaluar nueve características NMJ morfológicas:. zona NMJ, perimetrales NMJ, número de boutons, longitud NMJ, NMJ rama más larga longitud, el número de islas, número de ramas, el número de puntos de ramificación, el número de zonas activas en el terminal NMJ.
Trastornos cognitivos tales como la discapacidad intelectual, trastorno del espectro autista y la esquizofrenia se caracterizan a menudo por una función anormal sináptica 1, 2, 3. morfología Synapse y función están estrechamente entrelazadas; defectos morfológicos pueden causar un mal funcionamiento sináptica y, a la inversa, la transmisión sináptica aberrante impactarán la maduración sináptica y la morfología 4, 5, 6.
Una serie de organismos modelo se han empleado con el fin de entender mejor la biología de la sinapsis y arrojar luz sobre cómo los cambios sinápticos afectan la función cerebral en salud y enfermedad 7, 8, 9. La Drosophila NMJ es una extensamente estudiada y bien establecido modelo in vivo para sy glutamatérgicanapse biología 10, 11. En las últimas décadas, este modelo se ha utilizado para los estudios fisiológicos y centrado genes, así como para las pantallas de genética a gran escala, con el objetivo de detectar diferencias morfológicas entre NMJs. En particular, las pantallas adelante genéticos han identificado muchos reguladores cruciales y mecanismos del desarrollo de sinapsis y la función 12, 13, 14, 15, 16. Sin embargo, la mayoría de estas pantallas se basó en la evaluación visual de la NMJ morfología terminal y en la detección cualitativa de las anormalidades sinápticas o de puntuación semicuantitativa de algunas características morfológicas. Como consecuencia, más sutiles alteraciones morfológicas sinápticas que no son obvias para el ojo humano se pierden fácilmente. Con el fin de poder detectar diferencias cuantitativas forma integral, lasNMJ tiene que ser evaluada con precisión mediante la cuantificación sistemática de los parámetros morfológicos de interés. La medición de características NMJ manual es laborioso, especialmente cuando hay varias características NMJ de interés y / o cuando se realizan pruebas de detección genéticos a gran escala. Para apoyar multiparamétrica, análisis morfológico de alto rendimiento y para lograr la cuantificación objetiva, dos macros "Drosophila NMJ morfometría" y "Drosophila NMJ Bouton morfometría" se desarrollaron 17. Ambas macros se ejecutan en el software de código abierto de análisis de imágenes Fiji 18, y pueden cuantificar ambas imágenes confocal y nonconfocal.
Medidas "Drosophila NMJ morfometría" terminales NMJ inmunoteñidas con el disco postsináptica marcador de gran-1 (Dlg-1) o la peroxidasa de rábano picante presináptica (HRP), co-etiquetados con el Bruchpilot marcador de zona activa (BRP). Cuantifica nueve paráme morfológicaTER (descrito más adelante): área NMJ, perimetrales NMJ, número de boutons, longitud NMJ, NMJ más larga longitud de rama, número de islas, número de ramas, número de puntos de ramificación, el número de zonas activas en la terminal sináptica (Figura 1) . Aunque un algoritmo para determinar el número de boutons está presente en esta macro, que no cumplía con los criterios de exactitud 17. Para evaluar adecuadamente el número de boutons, es necesario utilizar la macro "Drosophila NMJ Bouton Morfometría", que está diseñado específicamente para cuantificar boutons utilizando preparaciones NMJ inmunoteñidas por anti-sinaptotagmina (Syt) o proteína de cadena anti-Cisteína (Csp), y co-immunolabeled con Brp. La macro "Drosophila NMJ Bouton Morfometría" cuantifica los siguientes parámetros: número de boutons, área Bouton NMJ, longitud NMJ, NMJ más larga longitud de la rama, número de islas, número de ramas, el número de puntos de ramificación y el número de zo activones (Figura 2).
Las macros consisten en 3 sub-macros: (I) "Convertir a apilar" identifica todos los archivos de imagen disponibles y crea Z-hyperstacks y proyecciones de máxima intensidad de ambos canales. Como salida, esta macro generará dos nuevos archivos por sinapsis llamada "stack_image_name" y "flatstack_image_name". II) "Definir ROI" se abrirá todas las imágenes de proyección máximos "flatstack_image_name" consecutivamente y presentarlos con la solicitud para definir manualmente la región de interés (ROI) en el que está presente el terminal sináptica específica de interés. Esto se implementó para permitir la exclusión de las sinapsis que conectan a los músculos adyacentes y / u otros tipos de terminales sinápticas (tales como 1s) que pueden estar presentes en las imágenes 11. (III) "Analizar" se aplica totalmente automatizado análisis a todas las regiones de las imágenes dentro de las fronteras de la ROI. Comoresultado de este paso, el usuario obtendrá dos nuevos archivos: "results.txt", donde se anotarán toda la medición numérica y un "res_image_name.tif", donde se ilustrarán las segmentaciones imagen subyacente producidos por la macro. Durante el análisis de imagen tres estructuras se derivan de cada terminal sináptica: el contorno NMJ, el esqueleto NMJ, y el número de zonas activas Brp-positivos. El contorno NMJ se utiliza para determinar el área NMJ y su perímetro y una separación de cuencas posterior proporciona el número de boutons. Desde el esqueleto, cinco características NMJ se deducen: la longitud total NMJ, la suma de la longitud de la trayectoria continua más larga que conecta dos puntos finales (la más larga longitud de la rama), el número de compartimentos no conectados por NMJ (referido como "islas" ), el número de ramas, y el número de puntos de ramificación (un punto de ramificación conecta tres o más ramas). El número de zonas activas se determina en el Brp canales contandomanchas BRP-positivas. El esquema anotado NMJ (línea amarilla), el esqueleto NMJ (línea azul), y el número de zonas activas Brp-positivos (indicados por focos blanco) se visualizan en un cuadro los resultados y las medidas de los parámetros se procesan a una (. txt) archivo de salida (Figura 3).
Drosophila NMJ Morfometría" y 'Drosophila NMJ Bouton Morfometría' se describieron primero y extensamente validados por Nijhof et al. 17. Este manuscrito se centra en la metodología de análisis de la morfología NMJ usando las macros 'Drosophila NMJ morfometría' y 'Drosophila NMJ Bouton morfometría'. Sin embargo, antes de los análisis macro-asistida, disecciones NMJ y immunostainings deban llevarse a cabo. Estos son pasos cruciales, y la combinación de marcadores utilizados para inmunohistoquímica tiene que ser adecuado para los análisis de macro. Estos pasos se mencionan brevemente en sEcción 1 de este protocolo y dirigir al usuario a referencias que describen en detalle los protocolos para ejecutar estos procedimientos.
"Drosophila NMJ Morfometría" y "Drosophila NMJ Bouton Morfometría" son herramientas poderosas para los investigadores interesados en la evaluación de la morfología de la sinapsis. evaluación manual de los parámetros NMJ es laborioso; se estima que las macros se ahorrarían un investigador experimentado hasta 15 min / NMJ pasó en la segmentación manual de imagen. Con una o dos docenas de sinapsis evaluados por condición o genotipo, esto resume rápidamente hasta una cantidad considerable de tiempo ahorrado, incluso en estudios a pequeña escala. Al realizar grandes pantallas, la ganancia de la utilización de análisis de alto rendimiento, en comparación con la evaluación manual y la cuantificación, puede ser inmensa. Además de un mayor rendimiento, los macros proporcionan fácilmente análisis objetivo; excluyen a los prejuicios personales que de otra forma requieren experimentos ciegos, así como las diferencias interpersonales que se producen cuando varios investigadores participan en el análisis. Por último, las macros proporcionan una una sensible y precisoÁLISIS de características NMJ, lo que permite la identificación de reguladores sinápticas que causan más sutil que defectos NMJ dramáticos y hasta ahora han permanecido poco apreciado por el ojo del investigador. La información detallada sobre los procedimientos de validación y los algoritmos utilizados en las macros se encuentran en la publicación Nijhof et al. 17.
La funcionalidad de los macros se ha validado para medir apropiadamente características morfológicas de Drosophila melanogaster NMJs en músculo 4. Posteriormente, se demostró que las macros también eran adecuados para analizar las sinapsis en otros músculos en este organismo. Es probable que las macros también se pueden usar para medir los parámetros morfológicos de NMJ con estructura similar en otras especies, incluyendo otras especies de Drosophila y otros insectos. Incluso NMJs muy distantes en la evolución, por ejemplo, NMJs de ratones, muestran una conformación estructural bastante similar 29. Las macros no se han probado en los preparativos NMJ de otras especies, pero los usuarios potenciales se les anima a probar las macros para tales fines.
Es muy importante que el usuario explora los diferentes umbrales de automóviles y algoritmos para definir / seleccionar los ajustes de macro más adecuados para las imágenes. Con estos ajustes, se logra una precisión de aproximadamente el 95% cuando la evaluación macro se comparó con la evaluación manual. Ajuste de los valores de la macro a adecuadamente segmento 100% de las imágenes puede ser un procedimiento muy laborioso o incluso imposible. Por lo tanto, la exclusión de las imágenes no segmentados correctamente se recomienda si su número es inferior al 5%. Evidentemente, si la calidad de las imágenes es baja, las macros se generan mayores proporciones de segmentaciones imagen insatisfactorios. Las imágenes de baja calidad influirán de manera similar la evaluación manual y por lo tanto no pueden ser ligada a la evolución de las macros. No obstante las macros son bastante robusta ya que fueron diseñados para una imagenS generada en un microscopio de alta contenido (un microscopio de fluorescencia automatizado que permite obtener imágenes de gran número de muestras) 17.
Un punto crítico es que el usuario inspecciona visualmente todas las imágenes resultado generado por las macros. Esto permitirá detectar y excluir las imágenes con la segmentación insatisfactorio. En la sección 6 de este protocolo, el usuario es guiado cómo ajustar la configuración de la segmentación de imagen correcta cuando se ejecuta el sub-macro "Analizar". Para familiarizarse rápidamente con los requisitos de las macros y cómo ajustar los valores de la macro una carpeta llamada "Examples_adjusting valores de la macro" está incluido en el repositorio de https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a macro. Trece subcarpetas, cada uno con ejemplos de imágenes obtenidas en diferentes plataformas de microscopio (microscopios alto contenido / confocal / fluorescencia) y diferentes immunostainings, se proporcionan. Un PDF titulado “guía Ejemplos” se incluye en el mismocarpeta en la que se proporcionan los ajustes requeridos para cada ejemplo, junto con un documento de texto que proporciona los resultados esperados y los resultados de las imágenes.
Las macros se han diseñado para procesar las imágenes guardadas como archivos separados .tiff, sin embargo, algunos usuarios podrían haber salvado sus imágenes en un formato diferente. La siguiente página web https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 contiene una carpeta con el nombre "Drosophila NMJ" donde tres archivos de ejemplo (Ejemplo 1 – 3) y la "Guía de ejemplos" de documentos con instrucciones detalladas de cómo importar imágenes en la macro si no se almacenan como archivos separados .tiff también se pueden encontrar en la misma carpeta.
En conjunto, las macros "Drosophila NMJ Morfometría" y "Drosophila NMJ Bouton morfometría" cuantificar diez diferentes características NMJ: área NMJ, perímetro NMJ, número de boutons, área Bouton NMJ, longitud NMJ, NMJ más larga que la longitud de la rama, número de IslaNDS, número de ramas, el número de puntos de ramificación y el número de zonas activas. Esto proporciona una gran ventaja sobre las herramientas disponibles hasta ahora que pueden evaluar sólo una o algunas de sus funciones sinápticas 30, 31. Análisis cuantitativo Multiparámetrico lleva un gran potencial para nuevos descubrimientos, por ejemplo, para identificar nuevos reguladores que controlan uno hasta numerosos aspectos de la biología sinapsis. También proporciona la resolución necesaria para determinar los genes que correguladores de exactamente las mismas o superposición de las características NMJ y por lo tanto es probable que operar en vías moleculares comunes. Por último, se abre la posibilidad de investigar cómo los diferentes parámetros sinápticos se correlacionan entre sí en condiciones inalteradas 17 y aseguran que los genes tales correlaciones morfométricos coordinados.
En su conjunto, este protocolo se ilustra cómo utilizar las dos macros "Drosophila NMJ Morfometría" y"Drosophila NMJ Bouton Morfometría", que realizan la cuantificación objetiva y sensible de diez características morfológicas NMJ en una forma de alto rendimiento.
The authors have nothing to disclose.
Reconocemos el centro de Centro de Recursos de Drosophila Viena y Bloomington Drosophila (NIH P40OD018537) para proporcionar cepas de Drosophila. Agradecemos a Jack Fransen desde el Centro de Imagen microscópica de apoyo de expertos en imágenes. Este estudio fue apoyado por becas VIDI y superior (917-96-346, 912-12-109) de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO), por dos becas de doctorado / Universidad de Radboud DCN Medical Center, por el Retraso Mental Red Alemana financiado por el programa NGFN + del Ministerio Federal alemán de Educación e Investigación (BMBF) y por Gencodys de la Unión Europea 7PM gran escala integrados de red (SALUD-241995) a AS. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Immunostainings | Dilution | ||
Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
Material | Company | Catalog number | Comments |
Equipment | |||
Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
Zeiss Axio imager | |||
Computer | Mac or Pc | ||
Material | Company | Catalog number | Comments |
Software | |||
FIJI |