プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製
Summary
ここでは、我々は簡単に、低コストを提供し、時間効率のよいプロトコルは、化学的に透過型電子顕微鏡のための免疫組織化学を事前に埋め込むと互換性のある長期保存を可能に、アクロレイン固定液と霊長類の脳組織を修正します。
Abstract
光学顕微鏡レベルでのすべての技術の進歩にもかかわらず、電子顕微鏡は、シナプスの連絡先などの神経細胞の超微細構造および形態学的な詳細を検討し、特徴づけるための神経科学における唯一のツールのまま。電子顕微鏡のための脳組織の良好な保存が厳しい低温定着方法によって得ることができるが、これらの技術は、かなり高価であると同定された神経系の接続性を理解することが重要である免疫標識の使用を制限します。凍結置換法は、免疫標識とクライオ固定の組み合わせを可能にするために開発されています。しかし、これらの方法論的アプローチの再現性は、通常は高価な凍結デバイスに依存しています。また、この技術の信頼性の高い結果を達成することは非常に時間がかかり、スキル困難です。したがって、特にアクロレイン固定伝統的な化学的に固定された脳は、電子を結合する時間効率および低コストの方法のままで免疫組織化学と顕微鏡。ここでは、霊長類の脳組織の維持につながり、プレ埋め込み免疫組織化学および透過型電子顕微鏡検査と互換性のある化学アクロレイン固定を使用して信頼性の高い実験プロトコルを提供します。
Introduction
共焦点及び二光子顕微鏡を含む光学顕微鏡は、他のものの1、2のうち、 インビボ神経プロセスで研究するための効率的なツールであることが証明されました。光学顕微鏡（LM）レベルでの典型的な空間分解能は約200nmであるが、このような極紫外線および軟X線顕微鏡などの異なる光源を用いた最近の技術の進歩は、特に、約10 nmの空間分解能3にこの解像度を増加しています、4、5。イメージングにおける他の技術的進歩は、組織学と組み合わせた磁気共鳴画像を含み、 インビボでミエリン鞘の厚さを測定するための新規な方法、唯一の電子顕微鏡（EM）レベル6,7に伝統的に測定可能であったパラメータを提供します。 AlthouGH LMレベルでのこれらの進歩は、シナプス接触の生体プロセス、構造の詳細図および特性を研究するための優れたツールを提供し、わずか0.5ナノメートルに達することができ、解像度を提供EM、を用いて達成することができます。しかし、EMレベルでの観察は、細胞構築を維持するために、化学固定剤と脱水プロセスと、いくつかの方法で死んで、変更する標本が必要です。従って、高解像度で生体試料を検査することは、放射電子ビームによる損傷、低コントラスト、膜の構造偏差、又は8、9、10を埋め込む以下脱水及びエポキシ起こり得るアーチファクトのも存在に挑戦することができます。
構造解析のために彼らの本来の形で標本を保存する「クライオビトリファイドセクションのEM」またはCEMOVIS、切片化アプローチを用いることによって達成することができます急速凍結及び硝子体氷で試料を埋め込み、極低温11、12にEM下のセクションを調べることを含みます。彼らはまだ固体と完全に水和している間、この手順は、このように脱水工程13に起因するアーチファクトを除去する、試料の検査を可能にします。しかし、この方法では、重要な追加コストを発生させる非常に低い温度でこの観察を可能にするために、凍結超薄切片のための追加の装置と同様に、標準のEMに関する追加のデバイスを必要とします。また、CEMOVISアプローチは、抗体は、通常、室温でインキュベートしなければならないため、技術を免疫標識の使用を妨げます。また、凍結固定した標本をゆっくりと凍結防止化学薬品に浸しながら解凍し、目されている、その間、凍結置換法を使用して免疫組織化学的方法で超微細構造解析を組み合わせることが可能ですエンなどLowicrylsなどの特殊な樹脂に包埋しました。ポスト埋め込み免疫標識は、その後、材料12上で実行することができます。しかし、凍結置換とクライオ固定技術は時間がかかります。彼らは、追加の装置の設置を必要とし、依然として低温14,15の使用にもかかわらず、有機溶媒および細胞構築を変更することができる化学固定液に露出されるようにサンプルを必要とします。したがって、特にアクロレインとLMとEMレベル、脳組織の化学的固定、の両方ですべての技術的進歩にもかかわらず、EM 16で免疫組織化学を結合する低コストおよび時間効率的な方法のままです。
過去数十年間で、多くの試みが最高の組織保存を提供アルデヒドの混合物を見つけるために行われました。 1960年代の前に、EMのために許容可能な結果を与えただけで化学固定液は、四酸化オスミウムました。しかし、四酸化オスミウムは、脳のような臓器を修正するために血管系を通してその使用を排除し、毒性の高い、高価です。アクロレインは、細胞構造17のEM観察に適した動物組織の保存のための信頼性の高い方法として、1950年代後半に導入されました。これは、より深く組織を貫通し、浸漬によって固定のために使用され、組織17の最小の収縮と細胞質成分の良好な保存を可能にする他のアルデヒドよりも速く反応します。そのような酵素および他のタンパク質18の生体分子化合物のより正確な局在化を可能にすることにより、新鮮な組織で使用される場合、このような特徴は、アクロレイン固定を他のアルデヒドを超える明確な利点を与えます。確かに、それは効率的stabiliとして、両生類及びげっ歯類を含む多くの種でEMレベルで可視化のための固定の、簡単で効率的かつ低コストの方法として、年間を通じて検証されていますZESペプチドおよびタンパク質は、抗原性を保持し、他のアルデヒド固定剤16、18、19、20、21と組み合わせて使用される場合、比較的無傷の超微細構造を提供します。げっ歯類におけるアクロレイン固定用プロトコルは、それ以来EM 16、22二重免疫標識を実施するために、特にPickel基によって、広範囲に標準化に使用されてきました。いくつかのグループは、ヒト以外の霊長類の脳組織23にアクロレイン固定を使用していました。しかし、我々の知る限り、効率的にEMが24を免疫標識と互換性のある非ヒト霊長類におけるアクロレインとの化学的固定を記述する一つだけ発表されたプロトコルがあります。
この記事では、我々は、効率的、化学的に非ハムを修正するための簡単で信頼性の高い方法を提供します免疫標識および送信EM検査を事前に埋め込むとともに、潜在的に長期保存を可能にアクロレインと霊長類の脳、。
Protocol
倫理文：動物を含むすべてのプロトコルは、Comitéデ保護デAnimauxドゥ大学ラバルによって承認されたと実験動物の管理と使用（エド2。）への動物管理者ガイドのカナダの協議会に合わせて行われました。ここで説明するプロトコルは、約800グラムの成体動物のために最適化しました。固定液の量は、動物の大きさに応じて調整する必要があります。 経心臓灌流用の溶液の?…
Representative Results
このセクションでは、我々は、化学的に3％のアクロレインの混合物、4％PFAで固定し免疫染色霊長類の脳組織の、送信EMレベルで、観察後に得られた代表的な結果を提示します。比較的無傷のミエリン鞘と二重膜（ 図2A）のニート可視化によって示されるように、我々は、超微細構造の良好な保存を達成しました。シナプス接点は、微小環境からニューロ?…
Discussion
この記事では、我々は、ヒト以外の霊長類の経心臓灌流およびEMのサンプル検査に適した事前埋め込み免疫組織化学のための信頼性の高いプロトコルを提示します。例えばCEMOVISような典型的なクライオEMは、脳の微細構造の良好な保存を提供するが、それはまた、免疫組織化学12の使用を制限します。クライオ置換およびTokuyaso技術を含む他の技術は、免疫組織化学を埋め込?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、自然科学とカナダの工学研究会（NSERC、MPに401848から2011）によってサポートされていました。 MPは、 フォンデRECHERCHEデュケベックサンテ（FRQ-S）からキャリア賞を受け取りました。 LEはFRQ-S（FRQ-S 14D 29441）から博士交わりの受信者でした。私たちは、技術支援のためにマリージョゼWallmanに感謝します。
Materials
| Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) | Fisher scientific | S374-500 | |
| Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) | EM Science | SX0710-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher scientific | S271-3 | |
| Hydroxymethyl aminomethane (THAM) | Fisher scientific | T370-500 | |
| HCl | EMD | HX0603-3 | 1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection. |
| NaOH | EMD | SX0590-1 | 5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection. |
| Acrolein (90%) | sigma | 110221 | 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection. |
| Autopsy venting table | Mopec | CE400 | |
| Electronic perfusion pump | cole parmer | masterflex L/S 7523-90 | |
| Needle (perfusion) | terumo | NN-1838R | 18G 1 1/2 |
| Needle | terumo | NN-2713R | 21G 1/2 |
| Ketamine | 20 mg/kg | ||
| Xylazine | 4 mg/kg | ||
| Acepromazine | 0.5 mg/kg | ||
| Scalpel | |||
| Scalpel blades | Feather lance | 201011 J9913 | No.22 for surgery and No. 11 for EM |
| Surgical scissors | |||
| Rongeurs | |||
| Vibratome | Leica | VT 1200S | Calibrate blade before each use, when the device allows it |
| Vibratome razor blade | Gillette | GIN 642107 | |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | 30% dilution |
| Ethylene glycol | Fisher scientific | E178-4 | 30% dilution |
| Sodium borohydride (NaBH4) | sigma | S-9125 | |
| Normal horse serum | Jackson immunoResearch Laboratories | 008-000-121 | 2% dilution |
| Cold-fish gelatin | Aurion | 900.033 | 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40% |
| Primary antibody, SERT | Santa Cruz biotechnology | SC-1458 | 1/500 dilution |
| Primary antibody, ChAT | Chemicon (Millipore) | AB144P | 1/25 dilution |
| Primary antibody, TH | ImmunoStar | 22941 | 1/1000 dilution |
| Biotinylated secondary antibody, goat | Vector laboratories | BA-9500 | 1/1000 dilution |
| Biotinylated secondary antibody, mouse | Vector laboratories | BA-2000 | 1/1000 dilution |
| Vectastain elite ABC kit | Vector laboratories | PK6100 | 8.8 µL/mL of A and B each |
| 3'3 diaminobenzidine (DAB) | Sigma | D5637 | 0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink. |
| Peroxide (H2O2) 30% | Fisher scientific | H-323 | 0,005% dilution |
| Osmium tetroxide (OsO4) | Electron microscopic science | 2% 19152 4% 19150 | Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection. |
| Durcupan water-repellent epoxy resin | sigma | A: M epoxy resin (44611) B: hardener 964 (44612) C: accelerator 960 (DY 060) (44613) D: plasticizer (44614) | Polymerize 48h at 58 °C before throwing in waste. |
| Alumium cups | Electron microscopic science | 70048-01 | |
| Ethanol | commercial alcohols | 1019C | Dilute in distilled water with appropriate concentration |
| Propylene oxide | Electron microscopic science | 20401 | Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood. |
| Non-coated medium glass slides | brain research laboratories | 3875-FR | Grease surface with mineral oil |
| Plastic film (Aclar embedding film) | Electron microscopic science | 50425-25 | Grease surface with mineral oil |
| Ultramicrotome | Leica UC7 | EM UC7 | |
| Diamond trimming tool (ultratrim) | Diatome | UT 1081 | Can use glass knife alternatively |
| Ultra 45° Diatome Diamond knife | Diatome | MC13437 | equipped with a boat |
| Xylenes | Fisher scientific | X5SK-4 | |
| 150-mesh copper grids | Electron microscopic science | G150-cu | |
| grid-box | Electron microscopic science | 71138 | Can store up to 100 grids |
| Sodium citrate | Anachemia | 81983 | |
| Lead nitrate | sigma | L-6258 | Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light. |
| Syringe | terumo | SS-05L | 5 mL |
| Syringe filter | corning | 431222 | 0.2 µm |
| Absorbing paper (bibulous paper) | Electron microscopic science | 70086-1 | |
| Parafilm | Laboratory film | PM-999 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 |
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Cite This Article
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