열 및 레이어에 수지상 형태학 분석
Summary
여기, 우리는 열 및 레이어 초파리 수질 신경 세포의 수지상 라우팅을 분석하는 방법을 보여줍니다. 워크 플로우는 추적 기준 열 배열 수지상 아버를 등록하기위한 3 차원 공간에서 수지상 구조를 분석하기위한 이미지 품질과 연산 툴을 개선하기 위해 이중 – 뷰 영상 법을 포함한다.
Abstract
이러한 플라이 눈 돌출부와 척추 피질과 같은 중추 신경계의 여러 영역에서 시냅스 회로 개발 동물 개발 및 정보 처리 동안 뇌 배선을 용이하게하는 층과 열이 구성되어있다. 특정 레이어 유형 특정 패턴의 정교한 수상 돌기 시냅스 후 뉴런은 적절한 시냅스 터미널 시냅스합니다. 플라이 수질의 neuropil 10 층과 약 750 컬럼으로 구성되어; 각 열은 유형 특정 방식으로 구 심성의 일부 7 종류의 축삭 단자와 일치 수질 뉴런의 38 이상 종류의 수상 돌기에 의해 신경 지배된다. 이 보고서는 이미지의 절차를 자세히 설명하고 수질 뉴런의 수상 돌기를 분석 할 수 있습니다. 워크 플로우는 세 부분으로 포함한다 : (I) 듀얼 뷰 촬상 부는 돌기 고해상도 3D 이미지에 직교하는 방향에서 수집 개의 공 초점 화상 스택을 결합하는 단계; (ⅱ) 수상 돌기는 추적 및 등록 섹션은 수지상를 추적3D의 아버와 기준 열 배열 수지상 트레이스 레지스터; (ⅲ) 수지상 분석 부는 수지상 정자 층 특정 종단 및 평면 투영 방향을 포함하여 열 및 층에 대하여 돌기 패턴을 분석하고, 수지상 분지와 종단의 주파수 추정치를 유도한다. 프로토콜은 매트릭스 실험실 언어의 오픈 소스 MIPAV (의료 영상 처리, 분석 및 시각화) 플랫폼 및 사용자 정의 도구 상자에 내장 된 사용자 정의 플러그인을 사용한다. 함께, 이러한 프로토콜은 세포 유형을 확인하고, 돌연변이 체의 결함을 결정하기 위해, 레이어 및 열들 초파리 수질 뉴런의 수지상 경로를 분석하는 전체 워크 플로우를 제공한다.
Introduction
개발하는 동안, 복잡하지만 틀에 박힌 분기 패턴에 신경 정교한 수상 돌기들은 시냅스 파트너와 시냅스를 형성한다. 수지상 분기 패턴은 신경 정체성과 기능의 상관 관계. 수지상 복잡성 및 필드 크기는 입력 된 숫자를 관리하면서 수지상 분지 아버의 위치는, 그들이받는 시냅스 입력의 종류를 결정한다. 따라서, 수지상 형태 학적 특성은 시냅스 연결 및 신경 계산을위한 중요한 결정이다. 이러한 비행 광학 로브와 척추 동물의 망막과 같은 복잡한 뇌의 많은 지역에서 시냅스 회로는 정보 처리 (1), (2)를 용이하게하기 위해 열과 층으로 구성되어 있습니다. 이러한 열과 층 조직에서는 뚜렷한 양상 프로젝트 축삭의 시냅스 전 뉴런 특정 층 (소위 계층 특정 타겟팅)에서 종료하고 규칙적인 2 차원 배열을 형성하는 (소위 칼레D 지형도), 시냅스 후 뉴런이 특정 계층에 적절한 크기의 돌기를 확장하면서 정확한 종류와 숫자의 시냅스 입력을받을 수 있습니다. 층 및 컬럼에 타겟팅 축삭 잘 3,4-를 연구 하였지만, 훨씬는 덴 드라이트가 특정 계층에 전달하고 올바른 연접 파트너 5 시냅스 연결을 형성하는 수용 필드를 적절히 확장 크기 방법에 대해 공지되어있다. 이미징 및 층과 열을 대상으로 정량화 수지상의 어려움은 기둥과 적층 뇌 구조에서 수지상 개발의 연구를 방해하고있다.
초파리 수질 신경 세포는 열 및 레이어 수상 라우팅 및 회로 어셈블리를 공부에 이상적인 모델이다. 플라이 수질의 neuropil는 3D 10 층의 격자 약 750 열로 구성되어있다. 각 열은 페이지를 포함하여 구 심성의 집합에 의해 신경 지배한다그 축삭 터미널 계층 별 패션 (6)의 지형도를 형성 L5 – hotoreceptors R7 / R8과 얇은 신경 L1. 수질 신경 세포의 약 38 종류가이 구 심성 (7)로부터 입력을받을 때마다 수질 항목과 특정 계층에 적절한 필드 크기와 정교한 수상 돌기에 존재한다. 수질의 시냅스 회로는 전자 현미경 수준에서 재구성되었다; 따라서, 시냅스 협력이 잘 8 7 설정됩니다. 또한, 수질 신경의 여러 유형의 레이블을 유전 도구 9, 10, 11 가능하다. transmedulla의 세 가지 유형 (TM) 뉴런 (TM2, TM9 및 Tm20)를 검사하여, 우리는 이전에 두 개의 세포 형 특정 수지상 특성을 확인했다 (ⅰ) Tm은 뉴런이 중 전방 또는 후방 방향으로 돌기 프로젝트를 (평면 PROJection 방향) 상기 세포 유형에 따라 및 (ii)의 수질 신경 돌기가 셀 타입 별 패션 (계층 별 종단) (12)에 특정 수질 레이어 종료. 층 및 열 단서 Tm은 반응을 방해 돌연변이가 이러한 속성의 독특한 측면에 영향을 미치는 반면, 평면 형상 돌기 방향과 레이어 별 종단은, Tm은 뉴런의 세 가지 유형을 구별하기에 충분하다.
여기, 우리는 열 및 레이어 (그림 1)에서 초파리 수질 신경 세포의 수지상 패턴을 조사하기위한 완벽한 워크 플로우를 제시한다. 첫째, 두 개의 공 초점 화상을 결합하는 맞춤형 소프트웨어를 사용하는 듀얼 뷰 촬상 방법은 고품질의 이미지를 생성 등방성 스택을 나타낸다. 이 방법은, 초 – 해상도 현미경에 의존하지 않고, 수지상 분기 안정적인 추적을 허용 고품질 이미지를 생성하는데 전용 종래 공 초점 현미경을 필요 이러한의 STED (유도 방출 고갈) 또는 구조적 조명. 둘째, 수지상 아버 트레이싱 및 기준 컬럼 배열 얻어진 돌기 추적을 등록하기위한 방법을 제시한다. 셋째, 수지상 분지와 종단 주파수에 대한 추정치를 유도뿐만 아니라, 평면 형상 돌기 방향과 수지상 층 특정 종단에 대한 정보를 추출하기위한 계산 방법을 나타낸다. 함께, 이러한 방법들은 3D 수지상 모폴로지에 기초하여 세포 형태의 분류에 돌기 패턴의 특성과 돌연변이의 잠재적 결함의 식별을 허용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 어떻게 이미지에와 초파리 수질 뉴런의 수상 돌기 아버 분석을 보여줍니다. 첫번째 섹션 듀얼 뷰 영상은 고해상도 영상 스택에 디컨 볼 루션 두 화상 스택의 조합을 설명한다. 두 번째 섹션, 수지상 추적 및 등록 기준 열 배열에 수질 뉴런의 수상 돌기의 추적 및 등록에 대해 설명합니다. 세 번째 섹션, 수지상 분석, 수지상 패턴을 분석하는 사용자 정의 스크립트의 사용을 설명…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다, 아동 건강 및 인간 개발 (C.-HL에 부여 HD008913)의 유니스 케네디 슈라이버 국립 연구소, 정보 기술 센터 (PGM, NP, ESM 및 MM).
Materials
| Software | |||
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | version 16.05 | for image deconvolution (https://svi.nl). commercial software |
| MIPAV | version 7.3.0 | for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/.). freeware | |
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaRetinalRegistration.class | freeware | ||
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandardColumnRegistration.class | freeware | ||
| Imaris | Bitplane | for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com). commercial software | |
| Vaa3D | for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/). freeware | ||
| Matlab | Mathworks | R2014b | for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com). commercial software |
| Matlab toolbox: TREES1.14 | v1.14 | for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html). freeware | |
| Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox | v1.0 | for calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Sample files | |||
| SWC file definition | http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html | ||
| The codes and sample files for image combination and registration | https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration | ||
| Reference point example | https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=1471880596000&api=v2 | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Computer system | |||
| MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later | 3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal) | ||
| Optional: Quadro4000 (or above) graphic card | Nvidia | for stereographic visualization of dendrites. | |
| Optional: NVIDIA 3D vision2 | Nvidia | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html | |
| Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2 | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Reagents for imaging | |||
| 24B10 antibody | The Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
| GFP Tag Antibody | Thermofisher Scientific | G10362 | |
| Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermofisher Scientific | A11034 | |
| Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 | Thermofisher Scientific | A21124 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mounting Clay | Fisher | S04179 | |
| 70% glycerol in 1X PBS | |||
| Cover glasses, high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9000-000 |
References
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