Det vev-spesifikk ekstracellulære matriks (ECM) er en viktig formidler av cellefunksjon. Denne artikkelen beskriver fremgangsmåter for syntese av rent, ECM-avledede skum og mikrobærere som er stabile i kultur uten behov for kjemisk tverrbinding for anvendelser i avansert 3D in vitro cellekultur modeller eller som pro-regenerative bioscaffolds.
Cellefunksjon medieres ved interaksjon med ekstracellulære matriks (ECM), som har komplekse vev-spesifikke sammensetning og arkitektur. Fokuset i denne artikkelen er på metoder for tilvirkning av ECM-avledet porøst skum og mikrobærerne for bruk som biologisk relevante substrater i avanserte 3D-in vitro-cellekulturmodeller eller som pro-regenerative stillasene og celleavleveringssystemer for vevsteknologi og regenerativ medisin. Ved hjelp av decellularized vev eller renset uløselig kollagen som et utgangsmateriale, kan de teknikker som anvendes for å syntetisere et bredt utvalg av vevs-spesifikke bioscaffolds med tilpassbare geometrier. Fremgangsmåten innbefatter mekanisk bearbeiding og mild enzymatisk spalting under dannelse av en ECM suspensjon som brukes for å fremstille de tredimensjonale skum eller mikrobærere gjennom kontrollert frysing og frysetørringsfremgangsmåter. Disse rene ECM-avledet stillasene er meget porøs, men likevel stabil uten behov for Chemical tverrbindingsmidler eller andre additiver som kan negativt påvirke cellefunksjonen. Stillaset egenskaper kan være innstilt i en viss grad ved å variere faktorer som for eksempel ECM suspensjon konsentrasjon, mekaniske bearbeidingsmetoder, eller syntesebetingelsene. Generelt er de stillasene er robuste og enkle å håndtere, og kan bli behandlet så vev for de fleste standard biologiske analyser, noe som gir en allsidig og brukervennlig 3D cellekultur plattform som etterligner det naturlige ECM sammensetningen. Samlet disse enkle fremgangsmåter for tilvirkning av tilpassede ECM-avledede skum og Mikrobærerne kan være av interesse for både biologer og biomedisinske ingeniører som vevs-spesifikke cellerikt plattformer for in vitro og in vivo anvendelser.
Den ekstracellulære matriks (ECM) består av et kompleks 3D-nettverk av proteiner, glykoproteiner og polysakkarider 1. En gang ble betraktet som en overveiende konstruksjons-rammeverk, er det nå velkjent at ECM inkorporerer et variert utvalg av bioaktive molekyler med viktige funksjonelle roller 2. Celle-ECM-interaksjoner kan direkte celleoverlevelse, adhesjon, migrasjon, proliferasjon, differensiering og tre. Mens hovedklasser av ECM makromolekyler er generelt godt konservert over vev og arter, har hvert vev en entydig matrise sammensetning og arkitektur 4. Totalt er den vevsspesifikke ECM en instruktiv mikromiljø som medierer funksjon fra den subcellulære til vev / organ skala 5.
På grunn av den kritiske rollen til ECM i formidling cellular funksjon, har det vært økende interesse for degen av ECM-avledet bioscaffolds for bruk i tissue engineering og regenerativ medisin. Spesielt er fremgangsmåten ifølge decellularization blitt omfattende undersøkt som et middel for å oppnå ECM fra et bredt spekter av vev for anvendelse som en stillasmateriell for vevsregenerering og celle levering 5, 6, 7. Decellularization innebærer vanligvis en rekke av mekaniske, kjemiske og / eller biologiske behandlingstrinn som er rettet mot fjerning av celler og cellulære komponenter, mens en ideell forårsaker minimale endringer i 3D-strukturen og sammensetningen av ECM 8. Gjennom kartlegging litteraturen, kan ulike decellularization protokoller bli identifisert for nesten alle vev i kroppen 7.
Mens decellularized vev kan anvendes direkte som implanterbare stillas eller 3D-cellekultur-substrater, kan cellulær infiltrasjonvære begrenset i vev med et tett ECM struktur 9. Videre kan den naturlige heterogenitet i ECM forårsake variasjon i cellefesting og distribusjon innenfor decellularized matrisene, noe som potensielt kan påvirke den cellulære respons 10. Totalt sett, mens lovende for noen anvendelser å anvende decellularized vev i sin intakt form gir begrenset fleksibilitet når det gjelder avstemningsstilla egenskaper, inkludert form, porøsitet og stivhet, så vel som leveringsmåten for in vivo applikasjoner.
For å omgå disse begrensninger er en rekke forskningsgrupper påføre ytterligere prosesseringsmetoder for å generere tilpassede stillas formater ved hjelp av decellularized vev som et basismateriale. I den enkleste formen, kan det dreie seg cryomilling de decellularized vev til å danne injiserbare vevsspesifikke ECM-partikler 11. Disse ECM-partikler kan bli inkorporert som en celle-instrumentctive komponent i kompositt stillaser med andre biomaterialer, for eksempel in situ kryssbinding av hydrogeler 12, 13, 14. I tillegg til mekanisk bearbeiding, kan decellularized vev også bli utsatt for enzymatisk nedbrytning med proteolytisk og / eller glykolytiske enzymer å fremstille ECM-avledet hydrogeler, skum, mikrobærere, og beleggene 15, 16, 17, så vel som for å syntetisere bioinks for 3D-utskrift 18.
I tillegg til vev-tekniske anvendelser, ECM-avledet bioscaffolds stort potensial med henblikk på generering av høyere fidelity in vitro-modeller for biologisk forskning. Det er et betydelig behov for å utvikle 3D-cellekultursystemer som bedre rekapitulere de innfødte mobilmikro 19. De fleste in vitro-cell kulturstudier hittil er utført på vevskulturpolystyren (TCPS), som har liten sammenheng med den biologisk sammensatt og dynamisk cellulære miljø innenfor levende vev 20. Mens det er praktisk for å studere cellulære interaksjoner i et kontrollert miljø, å dyrke cellene på følgende forenklede stive 2D substrater endrer cellebinding og morfologi, så vel som både celle-celle og celle-interaksjoner ECM 21, 22. De cellulære tilpasninger observert på 2D TCPS kan påvirke intracellulære signalveier som regulerer forskjellige cellefunksjoner overlevelse, proliferasjon, migrering og differensiering, heve spørsmål om relevansen av 2D studier i modellsystemer in vivo 23. Det har vært en økende erkjennelse av at celle oppførsel kan variere sterkt i 2D-3D-systemer sammenlignet med 24, og det biokjemiske og biomechanical signalering med ECM-er viktige mediatorer for cellefunksjon 25. Mange grupper har forsøkt å overvinne begrensninger av etablerte 2D systemer ved å belegge TCPS med ECM-komponenter så som kollagen, laminin og fibronektin. Selv om disse strategiene kan forbedre cellebinding og kan endre cellulære responser, forblir disse modellene begrenset av deres 2D konfigurasjon som hermer ikke den komplekse romlige organisasjon eller biokjemi av det native ECM 26, 27.
Våre laboratorie bioteknologi har vært interessert i utvikling av ECM-avledet bioscaffolds som substrater for 3-D cellekultur og vev-tekniske anvendelser. Spesielt har vi banebrytende bruken av decellularized fettvev (DAT) som et stillas plattform for adipose regenerering 28. Videre har vi etablert metoder for å syntetisere 3D-mikrobærere og porøse skum under anvendelse av DAT spaltet med det proteolytiske enzym pepsin eller glykolytisk enzym α-amylase 29, 30, 31. Spesielt har vi demonstrert i alle disse stillas formater som adipose-avledet ECM gir en induktiv mikromiljø for adipogene differensiering av human adipose-avledet stammen / stromale celler (ASCs) i kultur. Mer nylig utvidet vi fremstillingsmetoder til å frembringe 3D-porøst skum fra α-amylase-spaltet fra svin decellularized venstre ventrikkel (DLV) (decellularization metoder tilpasset fra Wainwright et al. 32), og viste at de gir en støttende plattform for å indusere tidlig cardiomyogenic markør ekspresjon i humane pericardial fettavledet ASCer 31.
Denne artikkelen beskriver i detalj metoder for å syntetisere ikke-kjemisk tverrbundne 3D porøst skum og mikrobærere avledet utelukkendefra α-amylase-spaltet ECM for bruk som biologisk kompleks 3D-in vitro-cellekultur substrater og som biomaterialer for vevsregenerering. I teorien kan hvilken som helst kilde som inneholder ECM høy molekylvekt kollagen anvendes som utgangsmateriale for disse teknikkene. For å vise fleksibiliteten av denne tilnærmingen, har fremgangsmåter blitt anvendt for å generere vevsspesifikke bioscaffolds anvendelse av humant DAT, porcine decellularized hudvevet (DDT) 8, og porcine DLV som representative eksempler. Figur 1 gir en visuell oversikt over fabrikasjonsprosessen for ECM-avledede skum og mikrobærere.
Figur 1. Oversikt over Fremgangsmåte for fremstilling av vevs-spesifikke ECM-avledede skum og Mikrocarriers. 1. Decellularized vev, fremstilt ved å følge etablert retardasjonlularization protokoller kan anvendes for vev-spesifikk ECM-avledet bioscaffold fabrikasjon. Makroskopiske bilder vises av hydratisert human DAT (fremstilt som beskrevet i Flynn 2.010 28), svine-DDT (fremstilt som beskrevet i Reing, JE, et al., 2010 8), og porcint DLV (fremstilt som beskrevet i Wainwright et al. 2010 32 ), som representative eksempler på ECM kilder som kan brukes som utgangsmaterialer. Skala stolper representerer 3 cm. 2. decellularized vev lyofiliseres, og deretter 3. mekanisk hakket. Skala stolper representerer 1 cm. 4. Det finhakkede ECM kan deretter cryomilled, som er valgfri for skum fabrikasjon, men som er nødvendig for mikrobæreren syntese. Skalastolpe representerer 3 mm. 5. hakket eller cryomilled ECM blir deretter spaltet med α-amylase og homogenisert for å skape en homogen suspensjon ECM. Skalastolpe betegner 1 cm. <strong> 6a) for skumfremstillinger blir ECM'en suspensjonen overført til en brukerdefinert mugg, frosset og lyofilisert for å generere en 3D-porøs stillas med en veldefinert geometri. Skalastolpe betegner 1 cm. 6b) For mikrofremstillinger blir den cryomilled ECM suspensjon electrosprayed å generere adskilte sfæriske mikrobærere. Skalastolpe representerer 2 mm. 7. Skum og mikrobærere kan deretter gradvis rehydrert og podet med cellene. Representative bilder vises av humane ASC (levedyktige celler = grønn) sådd ut på en DAT skum (til venstre) og DAT mikrobæreren (til høyre). Skala stolper representerer 100 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Generelt kan bioscaffolds avledet fra decellularized vev mer nært tilnærmet den komplekse 3D-sammensetning og struktur av ECM i den native cellulære mikromiljø, sammenlignet med syntetiske stillas eller standard-kulturmodeller basert på 2D TCPS. Som tidligere omtalt, celle-ECM-interaksjoner er kritisk viktige for å mediere celle oppførsel både i kultur og i legemet 1. Erkjennelsen av at de biokjemiske, biofysiske og biomekaniske egenskapene til ECM er unike for hver vev, er det økende bevis for å støtte begrunnelsen for å bruke vevsspesifikke tilnærminger i utformingen av biomaterialer for tissue engineering, samt i utviklingen av mer fysiologisk relevante kultur modeller for in vitro eksperimenter 20. Utnytte decellularized vev som utgangsmateriale, kan våre fremgangsmåter innlemme den komplekse sammensetning av den vevsspesifikke ECM innenfor mer Customizable stillas formater. Mens de mekaniske og enzymatiske behandlingstrinn vil resultere i et tap av det native ECM ultrastruktur har tidligere undersøkelser med DAT viste at instruktive effektene av adipose-avledede ECM er konservert i disse stillas formater, noe som tyder på at bioscaffold sammensetningen er en nøkkel-mediator av cellefunksjon 11, 29. En betydelig fordel ved å bruke ECM-avledede skum og mikrobærere som cellekultur substrater sammenlignet med de intakte decellularized vev er at de er mer homogene, noe som kan forbedre jevnheten i fordelingen celle og celle-celle / celle-ECM-interaksjoner.
Metodene som beskrives her kan benyttes til å generere et bredt utvalg av vevs-spesifikke bioscaffolds for bruk i cellekultur og vev-tekniske anvendelser. For eksempel, i tillegg til DAT, DDT, og DLV, vår lab har med hell brukt disse teknikkene for å generere 3D porlige skum under anvendelse av decellularized ben, brusk, nucleus pulposus, og ringrommet fibrose, så vel som kommersielt tilgjengelige, uløselige kollagen avledet fra bovin sene. Fra en in vitro perspektiv, kan disse bioscaffolds brukes som et grunnlag for høyere fidelity 3D kulturmodeller for å undersøke cellulær biologi, fysiologi eller sykdomspatologien 38, som bioaktive substanser in high-throughput medikament screenings plattformer 39, eller som instruktive matrikser for stammen celledifferensiering 40, 41. DAT, DDT og Dlv skum fremstilt i konsentrasjoner på 25 – 50 mg / ml er stabile i lang sikt in vitro kultur (testet opp til 28 dager). Videre kan alle tre typer av mikrobærere støtter celleadhesjon og celleformering under dynamiske forhold i en lav-skjær-spinnerkultur system (10 – 15 rpm) i minst 2 uker. For in vivo anvendelser er biokompatible og biodegradabare ECM-avledede skum og mikrobærerne være lovende som off-the-sokkel produkter for å stimulere konstruktiv vev remodellering og regenerering 11, 29. Videre kan celleadhesive stillasene benyttes som celleterapi leveringssystemer 42, 43. Som et eksempel ble DAT skum vist seg å fremme angiogenese og adipogenese når de inokuleres med allogene ASCer og implantert subkutant i en immunkompetent rottemodell 29. I forhold til den intakte DAT Skum den mer sterkt bearbeidet DAT degradert mye hurtigere, med en 50% reduksjon i volum er angitt ved 3 uker etter hvert som de ble integrert med vertsvev, og nesten fullstendig resorpsjon av 12 uker. Men skummene induserte også en mer potent angiogen reaksjon, noe som tyder på at enzymet-spaltet ECM hadde unike pro-regenerative virkninger. På samme måte kan de ECM-avledede mikrobærere bli anvendt som in vitro </ em> celledyrkingsunderlag innenfor dynamiske kultursystemer og som injiserbare celle leveringskjøretøy 11, 30, 44. Mer spesifikt, kan de med liten diameter og stort overflateareal av mikrobærerne muliggjøre levering av en stor mengde av celler i et lite volum, samtidig som det gir en matrise som kan bidra til å opprettholde cellenes levedyktighet og øke celle retensjon ved injeksjonsstedet 30. Før anvendelse i et hvilket som helst levende system, er det viktig å sørge for at kilden ECM er i det vesentlige fritt for antigene cellulære komponenter og / eller potensielt cytotoksiske decellularization reagenser som kan utløse en negativ vertsrespons 7.
Det proteolytiske enzym pepsin er vanlig brukt ved fremstilling av ECM-avledet hydrogeler 15. Pepsin er en ikke-spesifikk protease som vil fordøye kollagen og andre ECM-proteiner into 45 små fragmenter. Mens hydrogeler fremstilt fra pepsin-spaltet ECM er blitt rapportert å ha celle-rikt effekter, er en begrensning at disse materialene har en tendens til å være ekstremt mekanisk svak 46. I vår innledende utvikling av DAT mikrobærerne, benyttet vi et sammensatt tilnærming der pepsin-spaltet DAT ble kombinert med alginat og tilsettes dråpevis i CaCl2 for å danne sfæriske kuler 30. Perlene ble deretter foto-kryssbundet og alginat ble ekstrahert ved anvendelse av natriumcitrat. I tillegg til kravet for kjemisk tverrbinding, en nøkkel begrensning var at mikrobærerne fabrikkert med denne løsningen fått dårlig stabilitet under en størrelse i området 900-950 um 30. I stedet for pepsin, fremgangsmåtene som presenteres her benytte et mer mild oppslutning av ECM med den glykolytiske enzym α-amylase, som er postulert å spalte karbohydratgrupper fra telopeptide regioner av kollagen, og dermed øke løselighet i eddiksyre 37. Denne tilnærmingen muliggjør isoleringen av sterkt polymerisert kollagen som kan brukes til å generere rene ECM-avledede skum og mikrobærere uten behov for kjemisk tverrbinding eller andre tilsetningsstoffer. Disse bioscaffolds er stabilisert gjennom fysiske interaksjoner og hydrogenbindinger mellom godt bevarte kollagenfibriller, lik den kollagen i nativ ECM mikromiljøet.
Skummene er en svært fleksibel plattform som kan fremstilles i et bredt spekter av geometrier avhengig av den spesifikke formen valgt. For cellekulturstudier, kan skummet støpes direkte i TCPS brønners plater, for å fremstille belegg eller 3D stillaser med varierende tykkelse. For å fremstille 3D-skum med meget ensartede flater, er det anbefalt at en tilpasset formen er utformet som kan tettes på begge sider med plast eller glass-slides. Enten hakket eller cryomilled ECM kan brukes til å syntetisereskummet. Generelt har vi funnet at de cryomilled skum har en tendens til å være makroskopisk mykere og har en mer forstyrret ultrastruktur ved lavere konsentrasjoner 31, 36. Avhengig av vevskilde kan de ytterligere mekaniske prosesstrinn føre til forandringer i ECM sammensetning som kan påvirke cellefunksjonen. For eksempel, i vårt tidligere arbeid, ble laminin oppdaget i hakket DLV skum, men ikke cryomilled DLV skummer 31. I motsetning til dette ble collagen I, collagen IV, laminin og fibronektin påvist i både hakket og cryomilled DAT skummer 36. I tillegg til de mekaniske prosesstrinn, kan porøsiteten og porestørrelsen av skummene være innstilt til en viss grad ved å variere ECM suspensjonskonsentrasjon og frysetemperaturen 47. Generelt vil lavere konsentrasjon skum (~ 10 – 15 mg / ml) er kvalitativt mer porøs, men kan trekke seg sammen raskere og ha dårligstabilitet i langtidskultur 31, 36. Tilsvarende er en langsommere frysehastighet, typisk oppnådd ved et høyere frysetemperatur, kan resultere i større porer i skummet på grunn av størrelsen på iskrystallene som dannes under fabrikasjon 29. Alle disse parameterne kan påvirke celle-interaksjoner med de materialer, blant annet feste, infiltrasjon og ombygging. For eksempel kan cellevekst på skum som er fremstilt med høyere konsentrasjoner ECM være begrenset til overflateområdene, spesielt med hakket ECM-kilder og under statiske dyrkingsbetingelser 36.
For mikrobærerne, de viktigste parametrene som kan være innstilt er ECM suspensjon konsentrasjon, kanyletykkelse, og påtrykt spenning med høyere konsentrasjoner typisk man oppnådde mikrobærere som er mer stabile under langvarig dynamisk kultur. Etter start av electrospraying, ECM suspension dråpene bør raskt falle inn i sentrum av kolben, mot retningen av aluminiumsfolie kollektoren. For å hindre aggregering, er det viktig at kulene kontakt med flytende nitrogen før folien. Avstanden mellom nålen og overflaten av det flytende nitrogenet kan justeres for å møte disse kravene. Det er viktig å merke seg at optimaliseringen kan være nødvendig, avhengig av egenskapene til hver enkelt ECM kilde, særlig ved valg av konsentrasjonsområdet som vil generere stabile bioscaffolds. En annen viktig faktor er den decellularization protokollen som brukes for å generere utgangsmaterialer, idet decellularization metoder som forringer ECM eller tilstedeværelse av resterende reagenser (for eksempel overflateaktive midler) kan innvirke negativt på stabiliteten av de resulterende skum og mikrobærere. Hvis utfordringer er oppstått med bioscaffold stabilitet, alternativer som kan undersøkes inkluderer bruk en mer gradvis utvanning prosessen, øke ECM suspsjonen konsentrasjon, og utforskning hakket versus cryomilled ECM. Skulle alle disse alternativene ikke klarer å løse problemet, kan det være nødvendig å utforske alternative decellularization protokoller eller ECM kilder.
For å sikre reproduserbarhet ved stillas produksjon, må det utvises spesiell forsiktighet ved visse trinn i protokollen. Når cryomilling de decellularized vev, er det anbefalt at fresing utføres umiddelbart etter frysetørking i et tørt miljø for å redusere sannsynligheten for partikkelaggregatet på grunn av absorpsjon av fuktighet fra omgivelsene. Under mikrobærer fabrikasjon, er det foreslått at suspensjonen electrosprayed i små grupper, med et maksimalt volum på 3 ml, for å unngå problemer med prøven kjøling som kan resultere i tilstopping av nålen. Videre er det viktig at mikrobærerne er ikke tillatt å tine etter electrospraying prosessen. For å opprettholde deres sfærisk geometri og mekanisk stabilitet, microcarriers skal samles inn fra det flytende nitrogenet, transporteres i en flytende nitrogenfylt beholder, og lyofiliseres umiddelbart. Til slutt, for både skum og mikrobærerne, er det avgjørende at rehydrering trinnene utføres sakte over en periode på flere dager. Rask rehydratisering kan føre til strukturell kollaps på den makro- og / eller mikroskala. Videre rehydrering må skje langsomt for å unngå at det dannes små luftbobler i stillaset, noe som kan kreve en betydelig mengde av tid for å avgasse under lett vakuum.
Som konklusjon kan fremgangsmåtene som presenteres i denne artikkelen benyttes til å fremstille et variert utvalg av vevs-spesifikke skum og mikrobærere som består av rent, ikke-kjemisk tverrbundet ECM. En fordel for biologiske forskere er at bioscaffolds er lette å håndtere og kan behandles på samme måte som vev når det utføres analyser med teknikker som histologiske, immunhistokjemi, eller gen og proteinekspresjon analyser.I tillegg kan de ECM-avledede stillasene være enzymatisk nedbrutt for å ekstrahere tilsådde cellepopulasjoner eller kan brukes direkte som bionedbrytbare og biokompatible celle levering kjøretøy. Totalt, holder denne fleksible plattformteknologi stor nytte for mange anvendelser, inkludert for 3D-cellekultur-studier som undersøker cellefunksjon, som celleekspansjons substrater, og som pro-regenerative bioscaffolds.
The authors have nothing to disclose.
The Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) have provided funding for this work. The authors would like to acknowledge Dr. Amin Rizkalla for the use of his electrospraying system, the Nanofabrication Facility at Western University for use of SEM imaging equipment, the Mount Brydges Abattoir for the provision of porcine tissue samples, and Drs. Aaron Grant, Brian Evans, and Robert Richards for their clinical collaborations in support of this research.
Acetic acid, glacial | BioShop | ACE222.500 | |
Alligator clip leads | VWR | 470149-728 | |
Aluminium foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
a-amylase | Sigma | 101074694 | from Aspergillus aryzae |
Analytical balance | Sartorius | CPA225D | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004251 | With swinging bucket rotor for 15 and 50 mL centrifuge tubes |
Centrifuge tubes (15 mL) | Sarstedt | 62.554.205 | |
Centrifuge tubes (50 mL) | Sarstedt | 62.547.205 | |
Collagen from bovine achilles tendon (insoluble) | Sigma | C9879 | Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers |
Cryomilling system | Retsch | 20.745.0001 | MM 400 |
Dessicator | Fisher Scientific | 8624426 | For lyophilized ECM and bioscaffold storage |
DMEM: F12 Hams | Sigma | D6421 | Used for proliferation media |
Dewar flask | Fisher Scientific | 10-196-6 | Low form; volume range of 250 – 500 mL |
Double distilled water | From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System | ||
D-PBS | Wisent | 311425125 | |
ECM | Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32) | ||
Ethanol | Greenfield Specialty Alcohols Inc. | P016EAAN | Absolute |
Fetal bovine serum | Wisent | 80150 | Used for proliferation media |
Forceps | VWR | 37-501-32 | For transferring the foams |
Freezer (-20 °C) | VWR | 97043-346 | |
Freezer ( -80 °C) | Thermo Scientific | EXF40086A | |
Glass vials | Fisher Scientific | 03-339-26D | To store lyophilized cryomilled ECM |
Hand held homogenizer | Fisher Scientific | 14-359-251 | Speed: 8000 – 30,000 RPM |
Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes | Fisher Scientific | 14-261-17 | 10 X 95 mm |
Liquid nitrogen | For electrospraying | ||
Lyophilizer | Labconco | 7750021 | FreeZone4.5 |
Milling chamber | Retsch | 02.462.0213 | 25 mL volume recommended |
Milling balls | VWR | 16003-606 | 10 mm diameter, stainless steel recommended |
18G needle | VWR | C ABD305185 | For dispensing ECM suspension into moulds |
Orbital incubator shaker | SciLogex | 832010089999 | Temperature controlled (37 °C) |
Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Used for proliferation media |
Pipet-Aid XP | Mandel Scientific | DRU-4-000-101 | |
Retort stand | VWR | 470019-526 | |
Retort stand clamp | VWR | 21573-606 | |
Safety-Lok Syringe | BD | 309606 | 3 mL luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension |
Serological pipettes (10 mL ) | Sarstedt | 86.1254.001 | |
Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.001 | |
Sodium chloride | BioShop | 7647-14-5 | |
Sodium phosphate monobasic | BioShop | 10049-21-5 | |
Scoopula | VWR | 89259-968 | For collecting microcarriers |
Surgical scissors | VWR | 82027-590 | |
Syringe pump | VWR | 10117-490 | Microprocessor controlled |
High voltage power supply | Gamma High Voltage Research | ES30P-5W/DDPM | Capable of recommended 15 – 25 kV voltage range |
12-well plates | Fisher Scientific | 12565321 | For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected |
Winged infusion set | Terumo | 22258092 | 30 cm tubing length, 25 G 3/4 " recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter |