ل<em> في المختبر</em> نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص
Summary
الثقافة الجهاز كاملة من القرص الفقرية (IVD) يحافظ على مصفوفة الأم خارج الخلية، خلية الظواهر، والتفاعلات الخلوية مصفوفة. نحن هنا وصف نظام الثقافة IVD باستخدام الماوس قطني وIVDs الذيلية في وحدات العمود الفقري وظيفية، والعديد من التطبيقات التي تستخدم هذا النظام.
Abstract
الفقرية القرص (IVD) انحطاط هو مساهم كبير في آلام أسفل الظهر. وIVD هو مفصل ليفي غضروفي التي تعمل على نقل وتخفيف الأحمال في العمود الفقري. تتألف IVD من نواة اللبية-بروتيوغليكان الغني (NP) والكولاجين الغنية بالطوق تليف (AF) تقع في نهاية لوحات الغضروفية. جنبا إلى جنب مع فقرات المجاورة، وهيكل فقرات-IVD يشكل وحدة العمود الفقري وظيفية (الاتحاد السوفياتي السابق). هذه المجهرية تحتوي على أنواع الخلايا الفريدة فضلا عن مصفوفات خارج الخلية فريدة من نوعها. الثقافة الجهاز كاملة من الاتحاد السوفياتي السابق يحافظ على مصفوفة الأم خارج الخلية، الظواهر تمايز الخلايا، والتفاعلات الخلوية مصفوفة. وهكذا، تقنيات زراعة الأعضاء هي مفيدة بشكل خاص للتحقيق في الآليات البيولوجية المعقدة للIVD. هنا، نحن تصف النهج الإنتاجية العالية لزراعة كله قطني FSUs الفأر الذي يوفر منصة مثالية لدراسة آليات المرض والعلاجات للIVD. وعلاوة على ذلك، نحن تصف الصورةتطبيقات everal التي تستخدم هذه الطريقة الثقافة الجهاز لإجراء مزيد من الدراسات بما في ذلك على النقيض محسنة التصوير microCT وعالية الدقة النمذجة عنصر محدود ثلاثي الأبعاد من IVD.
Introduction
آلام أسفل الظهر (LBP) هو العامل الرئيسي للإعاقة العالمية وفقدان الإنتاجية في مكان العمل، وينفق الاميركيون وحدها ما يزيد على 50 مليار دولار على العلاج LBP 1. على الرغم من أن انتشارا، مسببات LBP لا تزال معقدة ومتعددة العوامل. ومع ذلك، القرص الفقرية (IVD) انحطاط هو من بين عوامل الخطر الأكثر أهمية ليرة لبنانية (2).
ويتكون من ثلاثة IVD المجهرية: والخارجي بالطوق تليف (AF)، ونواة اللبية الداخلية (NP)، واثنين من الصفائح الطرفية الغضروفية التي ساندويتش الهيكل كله قريب وبشكل أقصى 3. مع الشيخوخة وانحطاط، ومكونات IVD تتغير هيكليا، إنشائي، وميكانيكيا 4. وتشمل هذه التغييرات فقدان البروتيوغليكان والماء في NP، انخفض ارتفاع القرص، وتدهور الكفاءة الميكانيكية 5. هذه التعديلات هيكثيرا ما يكون مصحوبا السيتوكينات التي تعزز استجابة التهابية، وكذلك العدلة والجذر الظهري العقدة اقتحام الفضاء المشترك وبلغت ذروتها في سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى أعراض LBP 6.
دراسة آليات IVD انحطاط هو التحدي في البشر لأنه غالبا ما يكون من غير الممكن عزل سبب انحطاط قبل حدوث آلام أسفل الظهر. وهكذا، فإن المقاربة الاختزالية تبسيط النظام التجريبي وصولا الى الجهاز الخاص بالتحاليل المخبرية يسمح الآلية صقل المتغيرات السببية وفحص آثار المصب من 5. يتم تقليل النظام فقط سكان الخلية الأم والمحيطة المصفوفة خارج الخلية، مما يمكن تفسير مباشر للآثار مؤثرات الخارجية على انحطاط IVD. وعلاوة على ذلك، وانخفاض التكلفة وقابلية للنماذج الفئران، فضلا عن عدد كبير من الحيوانات المعدلة وراثيا 7، تسمح رانه فحص المستهدفة السريع لآليات التنكسية IVD والعلاجات المحتملة. هنا، نحن تصف نظام الجهاز ثقافة الفئران التي تحفظ IVD الخلوية والأنسجة الاستقرار أكثر من 21 أيام، مع التركيز بشكل خاص نظرا لأنماط التماثل الساكن والميكانيكية والهيكلية، والتهابات في IVDs. باستخدام هذه الطريقة، ونحن نراقب التغيرات الوظيفية للIVDs 'في الناجمة عن طعنة نموذج إصابة 8 إلى فهم آليات وراء تنكس القرص. وعلاوة على ذلك، نحن تصف العديد من التطبيقات لهذا الأسلوب الثقافة الجهاز لإجراء مزيد من الدراسات بما في ذلك على النقيض محسنة التصوير microCT وثلاثي الأبعاد النمذجة عالية الدقة من IVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويحدد هذا البروتوكول ثقافة الجهاز من الاتحاد السوفياتي السابق الفئران مع التركيز على رصد التغيرات البيولوجية في IVD. نجاحها في الحفاظ على هذه الثقافات يتطلب تقنيات معقمة دقيقة. على وجه الخصوص، تشريح الخطوات 2،1-2،6 وثقافة الخطوات من 3،1-3،6 يحتاجون إلى ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مركز جامعة واشنطن العضلية الهيكلية البحوث (NIH P30 AR057235)، مركز التصوير الجزيئي (NIH P50 CA094056)، ميكانيكا الأحياء التدريب غرانت (NIH 5T32EB018266)، NIH R21AR069804، والمعاهد الوطنية للصحة K01AR069116. فإن الكتاب أود أن أشكر باتريك وونغ لإسهاماته في مجال جمع البيانات.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
References
- Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).
- Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5 (6), 1-48 (2003).
- Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13 (3), 131-142 (1995).
- Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20 (24), 2690-2701 (1995).
- Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34 (8), 1431-1438 (2016).
- Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15 (6), 1347-1355 (2015).
- Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
- Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15 (4), 404-413 (2011).
- Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48 (10), 2189-2194 (2015).
- Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
- Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
- O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
- Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
- Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116 (12), (2014).
