En Rapid Automatisert Protokoll for Muscle Fibre Befolkning Analyse i Rat Muskeltverrsnitt Bruke Myosin Heavy Chain Immunohistokjemi
Summary
Her presenterer vi en protokoll for hurtig muskelfiber-analyser, noe som gir forbedret fargingskvalitet, og derved automatisk innhenting og kvantifisering av fiber populasjoner ved hjelp av den fritt tilgjengelig programvare ImageJ.
Abstract
Kvantifisering av muskelfiber populasjoner gir en dypere innsikt i virkninger av sykdom, trauma, og forskjellige andre påvirkninger på skjelettmuskel sammensetning. Ulike tidkrevende metoder har tradisjonelt blitt brukt til å studere fiber populasjoner i mange forskningsfelt. Imidlertid har nylig utviklet immunhistokjemiske metoder basert på myosin-tungkjedeprotein uttrykk gir en rask alternativ for å identifisere flere fibertyper i en enkelt seksjon. Her presenterer vi en hurtig, pålitelig og reproduserbar protokoll for bedret farging kvalitet, slik at automatiske innhenting av hele tverrsnitt, og en automatisk kvantifisering av fiber populasjoner med ImageJ. For dette formål er det innleiret skjelettmuskler kuttet i tversnitt, farget ved anvendelse av myosin-tungkjeder antistoffer med sekundære fluorescerende antistoffer og DAPI for cellekjerner farging. Hele tverrsnittet blir deretter skannes automatisk ved hjelp av en sklie skanner for å oppnå høy oppløsning sammensattbilder av hele prøven. Fiber populasjons analyser blir deretter utført for å kvantifisere langsomme, mellomliggende og raske fibre ved bruk av en automatisert makro for ImageJ. Vi har tidligere vist at denne metoden kan identifisere fiber populasjoner pålitelig til en grad på ± 4%. I tillegg reduserer denne metode inter-bruker-variasjon og tid per analyser vesentlig ved hjelp av åpen kildekode-plattform ImageJ.
Introduction
Skjelettmuskulatur sammensetningen gjennomgår dyptgripende forandringer under fysiologiske prosesser slik som aldring 1, 2, mosjon 3, 4, 5, 6, 7, eller patofysiologiske prosesser, slik som sykdom 8, 9, 10 eller 11 traumer. Derfor, til flere felt av forskning konsentrerer seg om de strukturelle virkninger av disse fremgangsmåter forstå funksjonelle forandringer. Ett av de viktigste aspektene som bestemmer muskelfunksjonen er sammensetningen av muskelfibre. Muskelfibre uttrykker forskjellig myosin tung kjede (MHC) -proteiner, og er derved klassifisert i langsomme, middels, eller raske fibre 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. Fysiologisk, muskler har forskjellige muskelfiber sammensetninger avhengig av deres funksjon i kroppen. Ved hjelp av muskelfiber skrive kan fiber populasjoner kvantifiseres for å identifisere tilpasning til fysiologiske eller patofysiologiske prosesser 7, 17. Historisk har en rekke tidskrevende metoder er blitt anvendt for å differensiere mellom muskelfibertyper. For dette formål ble muskelfibre klassifisert enten ved reaktiviteten av myosin ATPase ved forskjellige pH-nivåer eller muskelenzymaktivitet. Ettersom forskjellige fiberkvaliteter ikke kunne bli vurdert i en enkelt seksjon, ble multiple tverrsnitt som kreves for å identifisere alle muskelfibre og tillate manuell kvantifisering 14, 16, 17,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. I motsetning til nyere publikasjoner brukt immunhistokjemi (IHC) mot myosin-tungkjedeprotein for hurtig å sette flekker på flere fibertyper i en enkelt tverrsnitt. Basert på fordelene av denne prosedyren, er det nå regnet som gullstandarden i muskelfibrer populasjonsanalyse 19, 23, 24. Ved hjelp av forbedrede IHC fargingsprotokoller, var vi nylig kunnet vise at den fullt ut automatisk innhenting av hel muskel tverrsnitt, og en påfølgende automatisk muskelfiber kvantifisering er mulig ved hjelp av åpen kildekode-plattform ImageJ. Sammenlignet med manuelle kvantifisering, vår fremgangsmåte ga en signifikant reduksjon i tid (ca. 10% av manuelle analyser) som kreves pr lysbilde som samtidig er en nøyaktighet på ± 4% 25 </sopp>.
Det overordnede målet med denne metoden er å beskrive en hurtig, pålitelig og brukervennlig uavhengig veiledning til automatisk muskelfiber kvantifisering i hele rottemuskler ved hjelp av en åpen kilde plattform. I tillegg, beskriver vi mulige modifikasjoner som ville tillate dens anvendelse for andre prøver, slik som mus eller menneskelige muskler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser vi et allment tilgjengelig metode for å undersøke og kvantifisere automatisk muskelfiber populasjoner av rotte tverrsnitt gjennom immunhistokjemi i en tid effektiv måte. For reproduserbarhet presenterer vi en detaljert trinnvis beskrivelse og potensielle modifikasjoner for applikasjoner i andre arter som ikke er beskrevet i denne studien. Videre diskuterer vi fordelene med fremgangsmåten, en forutsetning for optimal funksjon og dens begrensninger.
For tiden er en rekke fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av den Christian Doppler Research Foundation. Vi vil gjerne takke Sabine Rauscher fra Core Facility Imaging ved Medical University of Vienna, Østerrike for støtte gjennom hele prosjektet. Primære antistoffer ble utviklet av Schiaffino, S., hentet fra utviklingsstudier Hybridomproduksjon Bank, skapt av NICHD av NIH og opprettholdt ved The University of Iowa, Institutt for biologi, Iowa City, IA.
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
References
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -. X., Yu, J. -. G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. . Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. c. h. r. i. j. v. e. r. s. -., Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
