Her presenterer vi en protokoll for hurtig muskelfiber-analyser, noe som gir forbedret fargingskvalitet, og derved automatisk innhenting og kvantifisering av fiber populasjoner ved hjelp av den fritt tilgjengelig programvare ImageJ.
Kvantifisering av muskelfiber populasjoner gir en dypere innsikt i virkninger av sykdom, trauma, og forskjellige andre påvirkninger på skjelettmuskel sammensetning. Ulike tidkrevende metoder har tradisjonelt blitt brukt til å studere fiber populasjoner i mange forskningsfelt. Imidlertid har nylig utviklet immunhistokjemiske metoder basert på myosin-tungkjedeprotein uttrykk gir en rask alternativ for å identifisere flere fibertyper i en enkelt seksjon. Her presenterer vi en hurtig, pålitelig og reproduserbar protokoll for bedret farging kvalitet, slik at automatiske innhenting av hele tverrsnitt, og en automatisk kvantifisering av fiber populasjoner med ImageJ. For dette formål er det innleiret skjelettmuskler kuttet i tversnitt, farget ved anvendelse av myosin-tungkjeder antistoffer med sekundære fluorescerende antistoffer og DAPI for cellekjerner farging. Hele tverrsnittet blir deretter skannes automatisk ved hjelp av en sklie skanner for å oppnå høy oppløsning sammensattbilder av hele prøven. Fiber populasjons analyser blir deretter utført for å kvantifisere langsomme, mellomliggende og raske fibre ved bruk av en automatisert makro for ImageJ. Vi har tidligere vist at denne metoden kan identifisere fiber populasjoner pålitelig til en grad på ± 4%. I tillegg reduserer denne metode inter-bruker-variasjon og tid per analyser vesentlig ved hjelp av åpen kildekode-plattform ImageJ.
Skjelettmuskulatur sammensetningen gjennomgår dyptgripende forandringer under fysiologiske prosesser slik som aldring 1, 2, mosjon 3, 4, 5, 6, 7, eller patofysiologiske prosesser, slik som sykdom 8, 9, 10 eller 11 traumer. Derfor, til flere felt av forskning konsentrerer seg om de strukturelle virkninger av disse fremgangsmåter forstå funksjonelle forandringer. Ett av de viktigste aspektene som bestemmer muskelfunksjonen er sammensetningen av muskelfibre. Muskelfibre uttrykker forskjellig myosin tung kjede (MHC) -proteiner, og er derved klassifisert i langsomme, middels, eller raske fibre 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. Fysiologisk, muskler har forskjellige muskelfiber sammensetninger avhengig av deres funksjon i kroppen. Ved hjelp av muskelfiber skrive kan fiber populasjoner kvantifiseres for å identifisere tilpasning til fysiologiske eller patofysiologiske prosesser 7, 17. Historisk har en rekke tidskrevende metoder er blitt anvendt for å differensiere mellom muskelfibertyper. For dette formål ble muskelfibre klassifisert enten ved reaktiviteten av myosin ATPase ved forskjellige pH-nivåer eller muskelenzymaktivitet. Ettersom forskjellige fiberkvaliteter ikke kunne bli vurdert i en enkelt seksjon, ble multiple tverrsnitt som kreves for å identifisere alle muskelfibre og tillate manuell kvantifisering 14, 16, 17,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. I motsetning til nyere publikasjoner brukt immunhistokjemi (IHC) mot myosin-tungkjedeprotein for hurtig å sette flekker på flere fibertyper i en enkelt tverrsnitt. Basert på fordelene av denne prosedyren, er det nå regnet som gullstandarden i muskelfibrer populasjonsanalyse 19, 23, 24. Ved hjelp av forbedrede IHC fargingsprotokoller, var vi nylig kunnet vise at den fullt ut automatisk innhenting av hel muskel tverrsnitt, og en påfølgende automatisk muskelfiber kvantifisering er mulig ved hjelp av åpen kildekode-plattform ImageJ. Sammenlignet med manuelle kvantifisering, vår fremgangsmåte ga en signifikant reduksjon i tid (ca. 10% av manuelle analyser) som kreves pr lysbilde som samtidig er en nøyaktighet på ± 4% 25 </sopp>.
Det overordnede målet med denne metoden er å beskrive en hurtig, pålitelig og brukervennlig uavhengig veiledning til automatisk muskelfiber kvantifisering i hele rottemuskler ved hjelp av en åpen kilde plattform. I tillegg, beskriver vi mulige modifikasjoner som ville tillate dens anvendelse for andre prøver, slik som mus eller menneskelige muskler.
Her viser vi et allment tilgjengelig metode for å undersøke og kvantifisere automatisk muskelfiber populasjoner av rotte tverrsnitt gjennom immunhistokjemi i en tid effektiv måte. For reproduserbarhet presenterer vi en detaljert trinnvis beskrivelse og potensielle modifikasjoner for applikasjoner i andre arter som ikke er beskrevet i denne studien. Videre diskuterer vi fordelene med fremgangsmåten, en forutsetning for optimal funksjon og dens begrensninger.
For tiden er en rekke fa…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av den Christian Doppler Research Foundation. Vi vil gjerne takke Sabine Rauscher fra Core Facility Imaging ved Medical University of Vienna, Østerrike for støtte gjennom hele prosjektet. Primære antistoffer ble utviklet av Schiaffino, S., hentet fra utviklingsstudier Hybridomproduksjon Bank, skapt av NICHD av NIH og opprettholdt ved The University of Iowa, Institutt for biologi, Iowa City, IA.
O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
phosphate buffered saline | |||
Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
Primary antibodies | |||
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
Secondary antibodies | |||
Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |