Быстрый Автоматизированный протокол для мышечного волокна Анализ населения в Rat Muscle разделов Креста с использованием тяжелой цепи миозина иммуногистохимии
Summary
Здесь мы приводим протокол для быстрого мышечного волокна анализов, что позволяет улучшить качество окрашивания, и, таким образом, автоматическое получение и количественное определение популяций волокна с использованием свободно доступного программного обеспечения ImageJ.
Abstract
Количественное популяций мышечных волокон обеспечивает более глубокое понимание последствий болезни, травмы, а также различных других воздействий на скелетные мышцы состава. Различные методы трудоемких традиционно использовались для изучения популяций волокна во многих областях исследований. Тем не менее, в последнее время разработаны иммуногистохимические методы, основанные на экспрессии белка тяжелой цепи миозина обеспечивает быструю альтернативу для идентификации различных типов волокна в одном разделе. Здесь мы представляем быстрый, надежный и воспроизводимый протокол для улучшения качества окрашивания, обеспечивая автоматическое приобретение целых сечений и автоматических количественное волокно популяций с ImageJ. Для этой цели, внедренные скелетные мышцы разрезают на поперечных срезах, окрашенных с помощью миозина тяжелых цепей антител с вторичными флуоресцентными антителами и DAPI для окрашивания ядер клеток. Целые сечения затем автоматически сканируются с помощью сканера слайдов для получения высокого разрешения композитафотографии всего образца. Анализ Fiber населения впоследствии выполняется для количественного определения медленных, промежуточных и быстрых волокон с использованием автоматизированной макрос для ImageJ. Ранее мы показали, что этот метод может идентифицировать популяции волокна надежно до степени ± 4%. Кроме того, этот метод уменьшает изменчивость и время на анализ значительно с помощью платформы с открытым кодом ImageJ между пользователем.
Introduction
Скелетная состав мышц претерпевает глубокие изменения во время физиологических процессов , таких как старение 1, 2, 3 упражнения, 4, 5, 6, 7 или патофизиологических процессах , таких как болезнь 8, 9, 10 или 11 травмы. Таким образом, несколько полей исследований концентрата на структурные последствия этих процессов для понимания функциональных изменений. Одним из ключевых аспектов, определяющих функцию мышц является составом мышечных волокон. Мышечные волокна выражают различный тяжелую цепь миозина (МНС) белки и , таким образом , подразделяются на медленные, промежуточные или быстрые волокна 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. Физиологически, мышцы имеют различные композиции мышечных волокон в зависимости от их функции в организме. Использование мышечных волокон ввода популяция волокна может быть количественно , чтобы определить адаптацию к физиологическим или патофизиологическим процессам 7, 17. Исторически сложилось, что целый ряд трудоемких методов были применены для различения между типами мышечных волокон. Для этого, мышечные волокна были классифицированы либо по реакционной способности миозина АТФазы при различных уровнях рН или активности мышц фермента. Поскольку различные качества волокон не могут быть оценены в одной секции, множественные поперечные сечения были необходимы для выявления всех мышечных волокон и позволяют ручной Количественное 14, 16, 17,= "Xref"> 18, 19, 20, 21, 22. В отличии от этого, последние публикации использовали иммуногистохимии (IHC) против тяжелой цепи миозина белка быстро окрасить несколько типов волокна в отдельных поперечных сечениях. Исходя из преимуществ этой процедуры, в настоящее время считается золотым стандартом в анализе мышечных волокон населения 19, 23, 24. Использование улучшенных протоколов окрашивания IHC, мы недавно были в состоянии показать, что полностью автоматическое получение цельных поперечных мышц секций и последующей автоматической количественной оценки мышечного волокна является возможным с использованием платформы с открытым исходным кодом ImageJ. По сравнению с ручным квантификации, наша процедура при условии , значительное снижение времени (примерно 10% от руководства анализа) , необходимого на слайд в то же время с точностью до ± 4% 25 </sвверх>.
Общая цель этого метода состоит в описании быстрый, надежный, независимый от пользователя руководство по автоматической квантификации мышечных волокон в мышцах крыс целых с помощью платформы с открытым кодом. Кроме того, мы опишем возможные модификации, которые позволили бы использовать его для других образцов, таких как мыши или человек мышцы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы демонстрируем общедоступное методологии для изучения и автоматически количественной оценки мышечных волокон популяции поперечных сечений крыс с помощью иммуногистохимии времени эффективно. Для воспроизводимости, мы приводим подробное пошаговое описание и возможных мо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Фондом Христиан Доплер Research. Мы хотели бы поблагодарить Сабин Раушер из изображений Facility ядра в Медицинском университете Вены, Австрии за поддержку на протяжении всего проекта. Первичные антитела были разработаны Schiaffino, S., полученные от развивающего исследований гибридом Банк, созданный NICHD НИЗ и поддерживается в Университете штата Айова, биологический факультет, Айова-Сити, штат Айова.
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
References
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -. X., Yu, J. -. G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. . Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. c. h. r. i. j. v. e. r. s. -., Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
