Här presenterar vi ett protokoll för snabb muskelfiberanalyser, vilket möjliggör förbättrad färgningskvalitet, och därmed automatisk förvärv och kvantifiering av fiber populationer med hjälp av fritt tillgänglig programvara ImageJ.
Kvantifiering av muskelfiber populationer ger en djupare insikt i effekterna av sjukdom, trauma, och olika andra influenser på skelettmuskelsammansättning. Olika tidskrävande metoder har traditionellt använts för att studera fiber populationer i många forskningsområden. Emellertid nyligen utvecklat immunohistokemiska metoder baserade på tunga kedjan från myosin proteinuttryck tillhandahålla ett snabbt alternativ för att identifiera multipla fibertyper i en enda sektion. Här presenterar vi ett snabbt, tillförlitligt och reproducerbart protokoll för förbättrad färgningskvalitet, vilket möjliggör automatisk inhämtning av hela tvärsnitt och automatisk kvantifiering av fiber populationer med ImageJ. För detta ändamål, är inbäddade skelettmuskler skurna i tvärsektioner, färgades med användning av myosin tunga kedjor antikroppar med sekundära fluorescerande antikroppar och DAPI för cellkärnor färgning. Hela tvärsnitt sedan scannas automatiskt med hjälp av en bild scanner för att erhålla hög upplösning sammansattbilder av hela provet. Fiberpopulationsanalyser därefter utföras för att kvantifiera långsamma, mellan- och snabba fibrer med användning av en automatiserad makro för ImageJ. Vi har tidigare visat att denna metod kan identifiera fiberpopulationer tillförlitligt till en grad av ± 4%. Dessutom reducerar denna metod interanvändar variabilitet och tid per analyser signifikant med hjälp av öppen källkod plattform ImageJ.
Skelettmuskelkompositionen undergår stora förändringar under fysiologiska processer såsom åldrande 1, 2, motion 3, 4, 5, 6, 7, eller patofysiologiska processer såsom sjukdom 8, 9, 10 eller trauma 11. Därför flera forskningsområden koncentrera sig på de strukturella effekterna av dessa processer förstå funktionella förändringar. En av de viktigaste aspekterna som bestämmer muskelfunktion är sammansättningen av muskelfibrer. Muskelfibrer uttrycka olika myosin tung kedja (MHC) -proteiner och därmed klassificeras i långsamma, mellanliggande, eller snabba fibrerna 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. Fysiologiskt, muskler har olika muskelfiberkompositioner beroende på deras funktion i kroppen. Med användning av muskelfibermaskinskrivning, kan fiberpopulationer kvantifieras för att identifiera anpassning till fysiologiska eller patofysiologiska processer 7, 17. Historiskt har ett antal tidskrävande metoder använts för att skilja mellan muskelfibertyper. För detta ändamål, var muskelfibrer klassificeras antingen genom reaktivitet av myosin ATPas vid olika pH-nivåer eller muskelenzymaktivitet. Som olika fiberkvaliteter inte kunnat utvärderas i en enda sektion, har flera tvärsektioner som krävs för att identifiera alla muskelfibrer och medge manuell kvantifiering 14, 16, 17,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. I kontrast, färska publikationer används immunohistokemi (IHC) mot tunga kedjan från myosin protein till snabbt färga flera fibertyper i en enda tvärsektioner. Baserat på fördelarna med detta förfarande är det nu anses vara den gyllene standarden i muskelfibrer populationsanalys 19, 23, 24. Med användning av förbättrade IHC färgningsprotokollen var vi nyligen kunnat visa att det helautomatiska förvärvet av hela muskel tvärsnitt och efterföljande automatisk muskelfiber kvantifiering är möjlig med användning av öppen källkod plattform ImageJ. Jämfört med manuell kvantifiering, vårt förfarande gav en signifikant minskning av tiden (ungefär 10% av manuell analyser) som krävs per bild samtidigt som den är en noggrannhet på ± 4% 25 </supp>.
Det övergripande målet med denna metod är att beskriva en snabb, tillförlitlig, användaroberoende guide till automatisk muskelfiber kvantifiering i hel råttmuskler med användning av en öppen källkod plattform. Dessutom beskriver vi potentiella modifieringar som skulle tillåta dess användning för andra prover såsom möss eller humana muskler.
Här visar vi en allmänt tillgänglig metod för att studera och automatiskt kvantifiera muskelfiber populationer av råtta tvärsnitt genom immunhistokemi på ett tidseffektivt sätt. För reproducerbarhet, presenterar vi en detaljerad steg för steg beskrivning och potentiella modifieringar för applikationer i andra arter som inte beskrivs i denna studie. Vidare diskuterar vi fördelarna med förfarandet, förutsättningar för optimal funktion och dess begränsningar.
Närvarande,…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av Christian Doppler Research Foundation. Vi vill tacka Sabine Rauscher från Core Facility Imaging vid medicinska universitetet i Wien, Österrike stöd under hela projektet. Primära antikroppar har utvecklats av Schiaffino, S., som erhållits från utvecklingsstudier Hybridoma Bank, skapad av NICHD av NIH och hölls vid University of Iowa, Institutionen för biologi, Iowa City, IA.
O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
phosphate buffered saline | |||
Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
Primary antibodies | |||
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
Secondary antibodies | |||
Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |