Análisis de terminación de la transcripción Uso Enfoque BrUTP-capítulo específico de la transcripción de ejecución en (TRO)
Summary
We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.
Abstract
Este manuscrito describe un protocolo para la detección de defecto de terminación de la transcripción in vivo. El protocolo TRO capítulo específico utilizando BrUTP describe aquí es un enfoque experimental poderosa para analizar el defecto terminación de la transcripción en condiciones fisiológicas. Al igual que el ensayo de TRO tradicional, se basa en la presencia de una polimerasa transcripcionalmente activo más allá del extremo 3 'del gen como un indicador de un defecto de terminación de la transcripción 1. Supera dos problemas importantes con el ensayo TRO tradicional. En primer lugar, se puede detectar si la polimerasa lectura a través de la señal de terminación es el que inicia la transcripción de la región próxima al promotor, o si es simplemente representa una polimerasa penetrante transcripción que inició de manera no específica de algún lugar del cuerpo o de la 3 ' final del gen. En segundo lugar, se puede distinguir si la señal de la polimerasa transcripcionalmente activo más allá de laregión terminadora es realmente la polimerasa mRNA sentido transcripción de lectura completa o una señal de ARN anti-sentido no codificante terminador iniciada. Brevemente, el protocolo implica permeabilización de las células de levadura en crecimiento exponencial, permitiendo que las transcripciones que iniciaron in vivo para alargar en presencia del nucleótido BrUTP, purificando el ARN marcado con BrUTP por el enfoque de afinidad, transcripción inversa el ARN naciente purificada y amplificar el ADNc usando cebadores específicos de cadena que flanquean las regiones de terminación del gen promotor y 2.
Introduction
El ciclo de la transcripción eucariótica consiste en tres pasos principales; iniciación, elongación y terminación. La terminación de la transcripción por la RNA polimerasa II consta de dos etapas distintas interdependientes 3. El primer paso implica la escisión, de poliadenilación y liberación de ARNm a partir de la plantilla, y es seguida inmediatamente por el segundo paso, marcado por el desacoplamiento de la polimerasa a partir de la plantilla. La terminación adecuada es crucial para el reciclado de la polimerasa durante la iniciación / reinicio de la transcripción, para la prevención de interferencia con la transcripción de genes aguas abajo, y para mantener la transcripción aberrante bajo control mediante la limitación de la transcripción de RNA penetrante 4, 5 no codificante. A pesar de los recientes avances, la terminación es de lejos el menos comprendido paso del ciclo de la transcripción de ARN polimerasa II. Un ensayo de terminación fiable es esencial para el estudio del mecanismo de underlying terminación de la transcripción por la ARN polimerasa II in vivo.
Un número de enfoques experimentales se utilizan para detectar el defecto de terminación en un gen de la transcripción de forma activa en condiciones fisiológicas. Estos incluyen transferencia Northern, chip factor de terminación (Inmunoprecipitación de cromatina) y el ensayo TRO tradicional. Cada una de estas técnicas tienen algunas ventajas y desventajas. El ensayo TRO tradicional solía ser el método más fiable y sensible para la detección de un defecto de terminación de la transcripción in vivo 1. Este ensayo se localizan las moléculas de polimerasa transcripcionalmente activos en las diferentes regiones de un gen dentro de la célula. En condiciones normales, el ensayo muestra moléculas transcriptionally comprometidos polimerasa estrictamente distribuidos entre el promotor y el terminador del gen de la región (Figura 1A). A la terminación defectuosa, sin embargo, la polimerasa es incapaz de leer la señal de terminacióny se detecta en la región corriente abajo del extremo 3 'del gen (Figura 1B).
Un defecto terminación de la transcripción se manifiesta en la presencia de un sentido de transcripción de la polimerasa que inicia a partir de la región próxima al promotor, y siendo incapaz de leer la señal de terminación, continúa la transcripción de la región aguas abajo del extremo 3 'de un gen, como se muestra en la figura 2A. Con la comprensión de que el genoma eucariota exhibe la transcripción omnipresente abrumadora en el sentido, así como las direcciones de sentido opuesto en los alrededores de un gen 6, 7, 8, 9, 10, pronto se hizo evidente que el ensayo TRO tradicional no puede detectar si la señal de la polimerasa aguas abajo de un gen representa una transcripción de promotor-iniciado (Figura 2A) o un ARN aberrante que inició somewhere en el medio del gen o aguas abajo del elemento terminador (Figura 2B), o la transcripción de la polimerasa en la dirección anti-sentido desde el extremo 3 'del gen (Figura 2C). El ensayo TRO específica de hebra usando BrUTP describe aquí puede distinguir si la señal de la polimerasa readthrough observado representa mRNA sentido extendido promotor-iniciado o un transcrito antisentido que inició aguas abajo del gen bajo examen. Hemos utilizado con éxito este método para demostrar el papel de Kin28 quinasa en la terminación de la transcripción de levadura en ciernes 2. Empleando el enfoque que aquí se muestra que Rna14 es necesaria para la terminación de la transcripción de levadura en ciernes ASC1.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo TRO capítulo específico utilizado aquí es una adaptación del protocolo utilizado para GRO-Sec (Global Run on-Sequencing) análisis en células de mamíferos 12. Hemos modificado con éxito el protocolo para estudiar la transcripción incipiente levadura en ciernes. Para analizar específicamente el defecto terminación de la transcripción, se ajustó el protocolo adicional mediante la eliminación de la etapa de hidrólisis de ARN. Esto nos permitió detectar específicamente la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.
Materials
| Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
References
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