Synthèse de cristaux liquides biocompatibles mousses élastomères comme échafaudages cellulaires pour les cultures de cellules spatiales 3D

Summary

Cette étude présente une méthode pour préparer 3D, biodégradables, des échafaudages de cellules en forme de mousse à base d'élastomères à cristaux liquides biocompatibles de la chaîne latérale (LCES). Des expériences de microscopie confocale montrent que LCES comme mousse permettent la fixation des cellules, la prolifération et l'alignement spontané de myoblastes C2C12s.

Abstract

Nous présentons ici une préparation étape par étape d'un échafaudage cellulaire 3D, biodégradable, comme la mousse. Ces échafaudages ont été préparés par co-polymères séquences de réticulation étoile comportant des unités de cholestérol en tant que groupes latéraux de la chaîne latérale, ce qui entraîne smectique A (SmA) des élastomères à cristaux liquides (LCES). Echafauds comme mousse, préparés en utilisant des modèles métalliques, disposent microcanaux interconnectés, ce qui les rend appropriés comme échafauds de culture cellulaire 3D. Les propriétés combinées de la structure régulière de la mousse métallique et du résultat élastomère dans un échafaudage cellulaire 3D qui favorise non seulement la prolifération cellulaire supérieure par rapport aux films templated poreux classiques, mais aussi une meilleure gestion du transport de masse (c. -à- nutriments, gaz, déchets , etc.). La nature du modèle métallique permet la manipulation aisée des formes en mousse ( par exemple, des rouleaux ou des films) et pour la préparation des échafauds de différentes tailles de pores pour les études de cellules différentes , tout en préservant la interconnected nature poreuse du modèle. Le procédé de gravure ne modifie pas la composition chimique des élastomères, en préservant leur nature biocompatible et biodégradable. Nous montrons que ces LCES smectiques, lorsqu'elles sont cultivées pendant des périodes longues, permettent l'étude des constructions de tissus cliniquement pertinentes et complexes, tout en favorisant la croissance et la prolifération des cellules.

Introduction

Il existe plusieurs exemples de matériaux synthétiques et biologiques biocompatibles destinés à être appliqués dans des études cellulaires et pour la régénération des tissus visant à la fixation des cellules et la prolifération ^{1, 2, 3, 4, 5.} Il y a eu quelques exemples de matériaux biocompatibles, connus comme des élastomères de cristaux liquides (LCES), qui peut répondre à des stimuli externes avec la commande anisotrope moléculaire ^{6, 7.} LCES sont des matériaux stimuli sensibles qui combinent les propriétés mécaniques et élastiques des élastomères avec la fonctionnalité optique et la commande moléculaire de cristaux liquides ^{8, 9.} LCES peuvent subir des modifications de forme, la déformation mécanique, un comportement élastique et des propriétés optiques en réponse à stim externesuli (ie., de la chaleur, le stress, la lumière, etc.) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Des études antérieures ont montré que les cristaux liquides (LC) peuvent détecter la croissance et l' orientation des cellules ^{4, 17.} Il est donc possible de supposer que LCES peuvent être appropriés pour des applications pertinentes biologiquement et médicalement, notamment échafaudage de cellules et d'alignement. Nous avons déjà signalé la préparation de smectiques LCES biocompatibles, biodégradables, coulé moulés et des films minces , avec une morphologie poreuse « type suisse de fromage » ^{6, 18.} Nous avons également préparé LCES biocompatibles nématiques avec la morphologie globulaire comme Echafaudages pour la croissance des cellules ¹⁹ <sup>, ^20. Notre travail vise à affiner les propriétés mécaniques des matériaux pour correspondre à celles du tissu d'intérêt ^21. En outre, ces études mettent l'accent sur la compréhension des interactions cellule-élastomère, ainsi que la réponse cellulaire lorsque les élastomères sont soumis à des stimuli externes.

Les principaux défis étaient en partie pour adapter la porosité des LCES pour permettre la fixation des cellules et la pénétration à travers la matrice élastomère et pour un meilleur transport de masse. La porosité de ces couches minces ⁶ a permis de permeation cellulaire à travers la masse de la matrice, mais pas tous les pores sont entièrement interconnectés ou avaient une taille de pores plus régulière (homogène). Nous avons rapporté ensuite les élastomères LCE nématiques biocompatibles avec morphologies globulaires. Ces élastomères nématiques autorisés pour la fixation et la prolifération des cellules, mais la taille des pores ne variaient de 10 à 30 um, ce qui a empêché ou limité l'utilisation de cesles élastomères ayant une plus grande variété de lignées de cellules ^{19, 20.}

Les travaux antérieurs de Kung et al. relative à la formation de mousses de graphène à l' aide d' un gabarit métallique « sacrificielle » a montré que la mousse de graphène obtenu avait une morphologie poreuse très régulier imposé par le gabarit métallique choisi ^22. Cette méthode offre un contrôle total de la taille de la porosité et pores. En même temps, la malléabilité et la flexibilité du modèle métallique permettent la formation de différentes formes modèle avant la préparation de la mousse. D' autres techniques, telles que le lessivage matériau ^23, le gaz texturation ^24, ou des fibres électro-filage ^{25, 26} offrent également le potentiel pour la préparation de matériaux poreux, mais ils sont plus longues et, dans certains cas, la taille des pores est limitée à seulement quelques micromètres. Mousse-comme LCES 3D préparés en utilisant des gabarits métalliques permettent une charge de cellule plus élevée; un taux de prolifération améliorée; co-culture; et, last but not least, une meilleure gestion des transports de masse (c. -à- nutriments, les gaz et les déchets) afin d' assurer le plein développement des tissus ^27. Mousseuse LCES 3D apparaissent également pour améliorer l'alignement des cellules; cela est probablement en relation avec les pendentifs LC détection de la croissance cellulaire et l'orientation des cellules. La présence de fragments de LC au sein du LCE semble améliorer l'alignement des cellules par rapport à l'emplacement de la cellule à l'intérieur de l'échafaudage pour LCE. Les cellules alignées dans les entretoises du LCE, alors qu'aucune orientation claire est observée lorsque les entretoises se rejoignent (jonctions) ^27.

Dans l'ensemble, notre plate-forme d'échafaudage de cellules LCE comme milieu de support cellulaire offre la possibilité de régler la morphologie des élastomères et des propriétés élastiques et pour diriger spécifiquement l'alignement des types de cellules (individuels) pour créer un arrangements spatiaux ordonnés, of cellules semblables à des systèmes vivants. En plus de fournir un échafaudage capable de soutenir et de diriger la croissance cellulaire à long terme et la prolifération, LCES permettent également des expériences dynamiques, où l'orientation des cellules et les interactions peuvent être modifiées à la volée.

Protocol

REMARQUE: Les étapes suivantes pour la préparation de mousse de type LCE 3D en utilisant le copolymère séquencé en étoile 3-bras sont représentés sur la figure 1. Pour la caractérisation par résonance magnétique nucléaire (RMN), les spectres sont enregistrés dans le chloroforme deutéré (CDCI3) à la température ambiante sur un instrument Bruker DMX 400 MHz et interne référencée pics résiduels à 7,26. Transformation de Fourier des spectres infrarouge (FT-IR) …

Representative Results

Ce rapport indique le procédé de préparation d'un LCE 3D poreux comme un échafaudage pour la culture cellulaire en utilisant une matrice de métal de nickel. Le 3D obtenu LCE démontre un réseau de canaux interconnectés complexe qui permet l' infiltration de cellules facile, ainsi que le transport de masse plus appropriée 27. Il a été constaté que les cellules sont capables de pénétrer entièrement le réseau de canaux interconnectés et sont ?…

Discussion

élastomères cristaux liquides ont récemment été étudiés comme échafauds de cellules biocompatibles en raison de leur réactivité stimuli. Ils se sont avérés être des plates-formes idéales comme échafauds cellulaires. Cependant, un facteur important de garder à l'esprit lors de la préparation et la conception d'un nouvel échafaudage LCE est la porosité. L'incorporation de solides lessivables ²³ ou de gaz ne se traduit pas toujours dans la porosité homogène ou pores …

Materials

1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper (I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000