Syntes av biokompatibla Liquid Crystal Elastomer Skum som Cell Ställningar för 3D Spatial cellkulturer

Summary

Denna studie presenterar en metod för att förbereda 3D, bionedbrytbara, skumliknande cell ställningar baserat på biokompatibla sidokedjeegenskaper flytande kristaller elastomerer (LCEs). Konfokalmikroskopi experiment visar att skumliknande LCEs möjliggöra cellvidhäftning, proliferation och den spontana anpassningen av C2C12s myoblaster.

Abstract

Här presenterar vi en steg-för-steg-framställning av en 3D, bionedbrytbar, skumliknande cellbyggnadsställningen. Dessa ställningar framställdes genom tvärbindning av stjärn segmentsampolymerer terar kolesterolheter som sidokedja vidhängande grupper, vilket resulterar i smektisk-A (SmA) flytande elastomerer kristall (LCEs). Skumliknande ställningar, framställes med användning av metallmallar, har med varandra förbundna mikrokanaler, vilket gör dem lämpliga som 3D-cell odlingsställningar. De kombinerade egenskaperna hos den regelbundna strukturen hos metallskum och av elastomer resultatet i en 3D-cellbyggnadsställning som främjar inte bara högre cellproliferation jämfört med konventionella porösa templated filmer, men även en bättre förvaltning av masstransport (dvs näringsämnen, gaser, avfall , etc). Arten av mallen metall möjliggör enkel manipulering av skum former (dvs rullar eller filmer) och för framställning av byggnadsställningar med olika porstorlekar för olika cellstudier samtidigt som interconnected porösa naturen av mallen. Etsningen Processen påverkar inte kemin av elastomerer, bevara deras biokompatibla och bionedbrytbara natur. Vi visar att dessa smekt LCEs, när den odlas under långa tidsperioder, gör det möjligt att studera kliniskt relevanta och komplexa vävnadskonstruktioner och samtidigt främja tillväxt och spridning av celler.

Introduction

Det finns flera exempel på biologiska och biokompatibla syntetiska material avsedda att appliceras i cellstudier och för vävnadsregenerering som syftar till cellvidhäftning och proliferation ^{1, 2, 3, 4, 5.} Det har funnits några exempel på biokompatibla material, kända som flytande kristall-elastomerer (LCEs), som skulle kunna reagera på yttre stimuli med anisotropa molekyl beställning ^{6, 7.} LCEs är stimuli-responsiva material som kombinerar de mekaniska och elastiska egenskaperna hos elastomerer med den optiska funktionalitet och molekyl beställning av vätskekristaller ^{8, 9.} LCEs kan uppleva förändringar i form, mekanisk deformation, elastiskt beteende, och optiska egenskaper som svar på externa stimuli (dvs., värme, stress, ljus, etc.) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Tidigare studier har visat att flytande kristaller (LCS) kan avkänna tillväxt och orientering av celler ^{4, 17.} Är det möjligt att sedan anta att LCEs kan vara lämpliga för biologiskt och medicinskt relevanta tillämpningar, inklusive cell byggnadsställningar och inriktning. Vi har tidigare rapporterat framställningen av smektiska biokompatibla, biologiskt nedbrytbara, gjutna-formade och tunna LCEs filmer presenterar en "Swiss-ost typ" porös morfologi ^{6, 18.} Vi förberedde också nematisk biokompatibla LCEs med klotformiga morfologi som byggnadsställningar för celltillväxt ¹⁹ <sup>, ^20. Vårt arbete syftade till trimma de mekaniska egenskaperna hos de material för att matcha de vävnaden av intresse ^21. Även dessa studier fokuserar på att förstå elastomer-cell interaktioner, samt cellulär respons när elastomerer är föremål för yttre stimuli.

De största utmaningarna var delvis att skräddarsy porositeten hos LCEs för att möjliggöra cellvidhäftning och permeation genom elastomermatrisen och för bättre masstransport. Porositeten hos dessa tunna filmer ⁶ tillåts för cellgenomträngning genom den största delen av matrisen, men inte alla porer var fullständigt sammankopplade eller hade en mer regelbunden (homogen) porstorlek. Vi rapporterade sedan på biokompatibla nematisk LCE elastomerer med klotformiga morfologier. Dessa nematiska elastomerer tillåts för fastsättning och tillväxt av celler, men porstorleken varierade endast 10-30 um, som förhindras eller begränsat användningen av dessaelastomerer med ett bredare utbud av cellinjer ^{19, 20.}

Tidigare arbete av Kung et al. om bildningen av grafen skum med användning av en "offer" metallmall visade att den erhållna grafen skummet hade en mycket regelbunden porös morfologi dikteras av den valda metallen mallen ^22. Denna metod ger full kontroll över porositet och porstorlek. På samma gång, den formbarhet och flexibilitet av mallen metall medge bildning av annan mall former före skumpreparat. Andra tekniker, såsom material urlakning ^23, gas schablon ^24, eller elektro spunna fibrerna ^{25, 26} erbjuder även möjligheten för framställning av porösa material, men de är mer tidskrävande och, i vissa fall, är porstorleken begränsad till endast ett fåtal mikrometer. Skum-liknande 3D LCEs ställdes med användning av metallmallar möjliggöra en högre belastningscell; en förbättrad proliferationshastighet; samodling; och sist men inte minst, bättre hantering masstransport (dvs. näringsämnen, gaser och avfall) för att säkerställa full vävnadsutveckling ^27. Skumliknande 3D LCEs verkar också för att förbättra cell inriktning; detta är mest sannolikt i förhållande till de LC hängen sensing celltillväxt och cellorienteringen. Närvaron av LC molekyldelar inom LCE synes förstärka cell inriktning med avseende på cell plats inom LCE ställningen. Celler rikta inom stöttorna hos LCE, medan ingen tydlig orientering observeras där stagen förenas (föreningspunkter) ^27.

Totalt sett vår LCE cell scaffold plattform som en cellstödmedium erbjuder möjligheter att avstämma elastomer morfologi och elastiska egenskaper och för att specifikt rikta anpassning av (enskilda) celltyper för att skapa en ordnad, rumsliga arrangemang of celler liknande levande system. Bortsett från att tillhandahålla en byggnadsställning som kan upprätthålla och styra långsiktig cellulär tillväxt och proliferation, LCEs tillåter även för dynamiska experiment, där cell orientering och interaktioner kan modifieras på fluga.

Protocol

OBS: Följande steg för 3D LCE skumliknande preparat med användning av 3-armsstjärn segmentsampolymer visas i Figur 1. För kärnmagnetisk resonans (NMR) karakterisering, är de spektra registreras i deutererad kloroform (CDCl 3) vid rumstemperatur på en Bruker DMX 400-MHz-instrument och internt refererade rest toppar vid 7,26. Fouriertransform infraröd (FT-IR) spektra registrerades med användning av en Bruker Vector 33 FT-IR-spektrometer med användning av dämpad total r…

Representative Results

Denna rapport visar framställningsmetoden av en porös 3D LCE som en ställning för cellkultur med användning av en nickelmetall mall. Den erhållna 3D LCE visar ett komplext sammankopplade kanalnätverk som möjliggör enkel cellinfiltration, såväl som mer lämpliga masstransport 27. Fann man att celler kan fullständigt penetrera det sammankopplade kanalnätet och har även möjlighet att anpassa inom LCE. Här, en metallnickelskum (99% Ni, densitet av 860 …

Discussion

Flytande kristallina elastomerer har nyligen undersökts som biokompatibla cell ställningar på grund av deras stimuli respons. De har visat sig vara idealiska plattformar som cell ställningar. Men det är en viktig faktor att tänka på när de förbereder och utforma en ny LCE ställning porositet. Införlivandet av lakbara fasta ämnen ²³ eller gaser inte alltid resultera i homogen porositet eller helt sammankopplade porer. Användningen av en mall metall som kan etsas ut inte bara ger möjl…

Materials

1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper (I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000