Rening av hög molekylvikt Genomiskt DNA från mjöldagg för lång Läs Sequencing
Summary
Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.
Abstract
Mjöldaggssvampar är en grupp av ekonomiskt viktiga växtsvamppatogener. Relativt lite är känt om den molekylära biologi och genetik för dessa patogener, delvis på grund av brist på välutvecklade genetiska och genomiska resurser. Dessa organismer har stora, repetitiva genom, som har gjort genomsekvensering och montering oöverkomligt svårt. Här beskriver vi metoder för insamling, extraktion, rening och kvalitetskontroll bedömning av högmolekylärt genomiskt DNA från en mjöldagg arter, Golovinomyces cichoracearum. Det protokoll som beskrivs innefattar mekanisk sönderdelning av sporer följt av en optimerad fenol / kloroform genom-DNA-extraktion. Ett typiskt utbyte var 7 ^ g DNA per 150 mg konidier. Det genomiska DNA som isoleras med användning av detta förfarande är lämplig för lång-läs sekvensering (dvs> 48,5 kbp). Kvalitetskontroll åtgärder för att säkerställa storleken, utbyte och renhet av det genomiska DNA är ocksåbeskrivs i denna metod. Sekvensering av det genomiska DNA: t av den kvalitet som angivits här kommer att möjliggöra montering och jämförelse av multipla mjöldaggs genom, som i sin tur kommer att leda till en bättre förståelse och förbättrad kontroll av denna jordbruks patogen.
Introduction
Mjöldagg är en grupp av obligat biotrophic växtsvamppatogener att när de tas tillsammans, är den största orsaken till växtsjukdomar i hela världen en. Det finns över 900 beskrivna arter av mjöldagg, som har taxonomiskt grupperade i fem stammar inom familjen Erisyphaceae 2. På grund av både deras ekonomiska betydelse och intim relation de utvecklar sina värdar har mjöldaggssjukdomar varit föremål för forskning för> 100 år. Vid infektion, mjöldagg framkallar drastiska förändringar i cellstrukturen, metabolism och molekylärbiologi för sina värdar, för att gynna denna patogen. Dock är studiet av mjöldagg särskilt utmanande på grund av deras obligat livsstil och tillväxt av svampen i ren kultur har ännu inte beskrivits 3, 4, 5,"xref"> 6, 7, 8. Tillförlitlig, stabil genetisk transformation av mjöldagg har inte heller ännu gjorts, även om övergående transformation har rapporterats i vissa arter 9, 10.
Den sekvensering och montering av mjöldagg genomen har visat sig vara svårt på grund av ett antal funktioner av genomet själv. Mjöldagg genomen är stora (120-180 Mbp) i förhållande till andra svamp genomen, och består vara 60 – 90% jämnt fördelade repetitiva element 11. Dessa element innefattar icke-långa terminala upprepningar, liksom okategoriserade repetitiva element. Två formae Speciales av en enstaka mjöldaggsarter, gräsmjöldagg f. sp. hordei och f. sp. tritici (bGH och BGT, respektive) liksom den druv mjöldagg Erysiphe necator, har been sekvenseras och utkast-genom för flera andra har avslutats 12, 13, 14. Den repetitiva naturen hos genomen har gjort montering svår, och den färdiga BGH-genomet samman till 6,989 supercontigs med en L50 av 2 Mb 12.
Trots det stora genomet, de mjöldagg verkar ha ett litet antal protein kodande generna, med 5.845 och 6,540 gener förutsagda i bGH och BGT, respektive. De sekvenserade mjöldagg verkar också saknar åtminstone 99 kärn gener som är väsentliga i andra svampar, vilket är förenligt med beroendet av de svampar på sin värdväxt för överlevnad 11, 12, 13, 14.
Repetitiva sekvenser nära telomerer, centromerer, ribosomal RNEn gen arrayer och områden berikade i omflyttbara element är dåligt ihop från kort läs sekvensestrategier och är ofta underrepresenterade i genomet aggregaten 15. Sådana regioner tros vara ansvarig för många av de luckor som förekommer i genomsekvenser, och detta gäller för de mjöldagg med deras omfattande expansion av repetitiva element 16. Mycket av plast genom regioner ofta i sådana repetitiva regionerna 3. De tjänar som ett område av kromosomomarrangemang och ofta kodar gener under starkt selektivt tryck, såsom de gener som kodar effektorproteiner och generna som kodar för enzymer av sekundär metabolism. Framsteg inom enda molekyl lång läsa sekvenseringsteknologier ger en möjlig lösning för sekvensering över repetitiva regioner av genom 15. Exempelvis Faino et al. (2015) fann att inbegripet lång sekvensen läsa teknik och optisk mapping tillät dem att producera ett gap-mindre genomsekvens för två stammar av svampväxt patogen Verticillium dahlia, tredubbling andelen repetitiva DNA-sekvenser i genomet, vilket ökar antalet gen annoteringar (och minska antalet partiella eller saknas gen annoteringar ) och avslöjande genomet omarrangemang 17.
Att utnyttja dessa långa-läs sekvenseringsteknologier, höga koncentrationer av hög kvalitet genom-DNA, med minimal storlekar> 20 kbp, behövs. Här beskriver vi våra metoder för konidial insamling, rening av högmolekylärt DNA från konidier och våra kvalitetskontrollbedömningar med hjälp av mjöldagg arter Golovinomyces cichoracearum odlas på gurka 18. Detta protokoll är baserat på ett protokoll som utvecklats i B. Keller laboratoriegrupp (University of Zurich, Zurich Schweiz) 13, 19och inkluderar flera modifieringar som ledde till ökade DNA-utbyten och en högre andel av DNA> 48,5 kbp i storlek. Protokollet innehåller även kontrollsteg kvalitet baserade på rekommendationer från Förenta staternas Department of Energy Joint Genome Institute 20, 21, 22.
Funktionen hos varje reagens som ingår i lysbuffert, och den logiska grunden för varje reningssteg, är såsom beskrivs i Henry (2008) 23. Tillgängliga publicerade protokoll för isolering av högmolekylärt genomiskt DNA från växt- och mikrobiella vävnader rådfrågades också under utformningen av detta protokoll 24, 25, 26, 27, 28.
Protocol
Representative Results
Discussion
I syfte att erhålla ren, med hög molekylvikt genomiskt DNA från den obligata biotrophic mjöldagg svampar, var en modifierad version av tidigare beskrivna metoder utvecklats 30. Den genomsnittliga avkastningen använder denna optimerade protokollet är 7 | ig DNA per 150 mg konidier, en fördubbling av utbyte som erhålles med ett tidigare protokoll. Också, ökade den genomsnittliga storleken från approximativt 20 kbp till över 48,5 kbp. Detta protokoll har optimerats i cucumber- G. cic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol was developed in support of a Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). The work was supported in part by the Philomathia Foundation, the National Science Foundation (#0929226) and the Energy Biosciences Institute to S. Somerville; and by Swiss National Science Foundation (#310030_163260) to B. Keller. We would like to thank our colleagues, M. Figureroa and M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) and S. Xiao (University of Maryland) for their generous advice and for volunteering their protocols as we developed the protocol described here.
Materials
| MM400 Ball Mill | Retsch | 20.745.0001 | Or equivalent ball mill |
| 2mL tubes for ball milling | Sarstedt | 72.694.007 | |
| 5/32" stainless steel milling balls | OPS Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 65°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 37°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Eppendorf 5417R refrigerated microcentrifuge | Krakeler Scientific | 38-022621807 | Or equivalent microcentrifuge |
| Chlorform:IAA (24:1 v/v) | Sigma-Aldrich | C0549 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v) | Thermo Fisher Scientific | 15593031 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| 100% Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Chill to -20°C prior use |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Rnase, Dnase-free (10mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Potassium metabisulfite | Sigma-Aldrich | P2522 | |
| Sodium Lauryl Sacroinate | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269 | |
| Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme | Staples | 423263 | Or equivalent eyewear |
| High Five COBALT nitrile gloves, LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | Or equivalent gloves |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000X in water | Biotium | 41003 | |
| Ethidium Bromide 10mg/ml | Biotium | 40042 | Hazardous in case of skin contact. Wear nitrile gloves and protective eyewear |
| Agarose Ultrapure Bioreagent | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1332 | |
| 8-48kb CHEF DNA size standards | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | Or equivalent pulse-field gel aparatus |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001042 | Or equivalent growth chamber |
| Percival Growth Chamber | Percival | AR66LXC9 | |
| NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | Or equivalent spectrophotometer |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Fisher Scientific | B49 | Dilute 1/50 with water before use (to 1X) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borate-EDTA, 10X Solution (Electrophoresis) | Thermo Fisher Scientific | BP13334 | Dilute 1/10 with water before use (to 1X) |
| Liquid Nitrogen | Liquid nitrogen (-196 °C) is a freezing hazard. It will also expand rapidly upon warming and should not keep in a tightly closed container |
References
- Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1969).
- Braun, U., Cook, R. T. . Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , (2012).
- Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen. Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).
- Glawe, D. A. The powdery mildews: A review of the world’s most familiar (yet poorly known) plant pathogens. Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).
- Fabro, G., et al. Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation. Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).
- Hückelhoven, R., Panstruga, R. Cell biology of the plant-powdery mildew interaction. Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).
- Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O’Connell, R. Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria. Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).
- Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators. Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).
- Spanu, P. D., Panstruga, R. Powdery mildew genomes in the crosshairs. New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).
- Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia. BMC Microbiol. 15 (20), (2015).
- Hacquard, S., Francis, M. M. . Advances in Botanical Research. 70, 109-142 (2014).
- Spanu, P. D., et al. Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism. Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).
- Wicker, T., et al. The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph. Nat Genet. 45 (9), 1092 (2013).
- Jones, L., et al. Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator. BMC Genomics. 15, 1081 (2014).
- Thomma, B. P. H. J., et al. Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies. Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).
- Parlange, F., et al. A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome. Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).
- Faino, L., et al. Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome. mBio. 6, (2015).
- Adam, L., et al. Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens. Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).
- Bourras, S., et al. Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew. Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).
- Henry, R. J. . Plant genotyping II: SNP technology. , (2008).
- Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species. Plant Methods. 10 (21), (2014).
- Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).
- Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta. Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105 (2015).
- Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).
- Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga. PLoS One. 9 (5), e96470 (2014).
- Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1. Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).
