La utilización de receptores de etiquetado pHluorin de Seguimiento de localización subcelular y el Tráfico

Summary

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

Abstract

Entendiendo la trata de proteínas de membrana, reunión y expresión requiere un enfoque que distingue entre aquellos que residen en organelos intracelulares y aquellos localizados en la membrana plasmática. Las mediciones tradicionales basados ​​en fluorescencia carecen de la capacidad de distinguir las proteínas de membrana que residen en diferentes orgánulos. Metodologías de corte de borde trascienden los métodos tradicionales de acoplamiento fluoróforos sensibles al pH con microscopía de fluorescencia de reflexión total interna (TIRFM). TIRF iluminación excita la muestra hasta aproximadamente 150 nm desde la interfaz vidrio-muestra, disminuyendo de este modo el fondo, el aumento de la relación señal a ruido, y la mejora de resolución. El volumen de excitación en TIRFM abarca la membrana plasmática y orgánulos cercanos, como la sala de emergencias periférica. Superecliptic pHluorin (SEP) es una versión sensible al pH de la GFP. Genéticamente que codifica septiembre en el dominio extracelular de una proteína de membrana de interés posiciona el fluoróforo enel lado luminal de la ER y en la región extracelular de la célula. SEP es fluorescente cuando el pH es mayor que 6, pero permanece en un estado apagado a valores de pH más bajos. Por lo tanto, los receptores de septiembre etiquetados con fluorescencia cuando residan en el retículo endoplásmico (ER) o después de la inserción en la membrana plasmática (PM), pero no cuando está confinado a una vesícula o el tráfico de otros orgánulos tales como el aparato de Golgi. El pH extracelular se puede ajustar para dictar la fluorescencia de los receptores en la membrana plasmática. La diferencia en la fluorescencia entre las imágenes TIRF a pH extracelular neutro y ácido para la misma célula corresponde a un número relativo de receptores en la membrana plasmática. Esto permite la medición simultánea de los receptores residentes intracelulares y de membrana plasmática. eventos de inserción individual de vesículas también pueden medirse cuando el pH extracelular es neutral, que corresponde a una vesícula de bajo tráfico de pH fusión con la membrana plasmática y la transición a un estado fluorescente. esta versatiltécnica e puede ser explotado para estudiar la localización, expresión, y el tráfico de proteínas de membrana.

Introduction

Los cambios en la expresión del receptor, la distribución, y el conjunto se han conectado a una amplia variedad de enfermedades, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, fibrosis quística, y adicción a las drogas ^{1, 2, 3, 4, 5.} Por ejemplo, la nicotina y otros ligandos nicotínicos influyen en el tráfico de los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) que conducen a los cambios en el tráfico, la expresión y la regulación positiva ^{1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10.} La nicotina aumenta el número total de nAChR ensamblados dentro de una célula, aumenta el tráfico hacia la membrana de plasma, unad altera el ensamblaje de las subunidades para favorecer una versión de alta sensibilidad de algunos subtipos. La resolución de distintos cambios en el tráfico, reunión y expresión de receptores en un modelo de enfermedad proporciona detalles mecanicistas cruciales que son esenciales para definir objetivos farmacológicos. Un enfoque ideal sería diferenciar rápidamente entre los receptores intracelulares y los localizada en la membrana plasmática. Esto es particularmente difícil en los casos en que una mayoría de una proteína particular reside intracelularmente, tal como con nAChR. Dado que la mayoría de nAChR se localiza en el retículo endoplásmico, las mediciones tradicionales tienen la resolución espacio-temporal necesaria para determinar los cambios de localización y de tráfico a lo largo de la vía secretora. Los estudios de tráfico de los receptores y la expresión de nAChR principalmente se han llevado a cabo mediante la unión de radioligando ^{11, 12} ensayos de biotinilación, Western Blot ^13, o TECHNIQ inmunoprecipitación UES ^12. Estos dependen de la especificidad de unión de una molécula indicadora o la fijación de las células y carecen de la capacidad de distinguir simultáneamente entre residente membrana plasmática y receptores intracelulares. Por lo tanto, los estudios de la dinámica de montaje de canales de iones y la vesícula se han basado en gran medida en las técnicas electrofisiológicas de bajo rendimiento ^14.

resolución espacial y temporal superior es posible con los avances en microscopía de fluorescencia. Las moléculas indicadoras genéticamente codificados, como la proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes, eliminar los problemas de unión no específica y aumentan la sensibilidad a ^15. Una variante sensible al pH de GFP, conocido como pHluorin superecliptic (SEP), se puede usar para explotar las diferencias de pH inherentes entre compartimentos dentro de una célula para determinar la localización ^{5, 7, 8,}ref "> ^{9, 16, 17, 18.} septiembre emite fluorescencia cuando el pH es superior a 6, pero permanece en un estado apagado a pH más bajo. Por lo tanto, los receptores etiquetados con septiembre de su lado luminal se detectan cuando está presente en el retículo endoplásmico ( ER) o tras la inserción en la membrana plasmática (PM), pero no cuando limita a una vesícula trata. la manipulación del pH extracelular en contacto con los receptores en la membrana plasmática en consecuencia, altera la fluorescencia y por lo tanto la detección de estos receptores. Si la misma célula se forma la imagen secuencialmente tanto a pH extracelular neutral y luego un pH inferior a 6, la diferencia entre las imágenes se atribuye a receptores situados en la membrana plasmática. Esto permite una medición simultánea de intracelular (ER periférica) y receptores de membrana residentes plasma ^{5, 7, 8} </sup> ^9. eventos de inserción individual de vesículas también se pueden resolver cuando el pH extracelular es neutral. Una vez que una vesícula de bajo tráfico de pH se fusiona con la membrana plasmática, el lado luminal de la vesícula se expone a la solución extracelular neutral, causando una transición detectada como una ráfaga de fluorescencia ^{7, 18, 19, 20.} Septiembre permite la medición de los receptores localizados en la membrana plasmática y retículo endoplasmático periférica, y proporciona un medio para medir el tráfico de los receptores entre estas regiones subcelulares ^{5, 7, 18.}

Para lograr una mayor resolución en la membrana plasmática, un receptor con la SEP codificados genéticamente se forma la imagen por microscopía de reflexión interna total de fluorescencia (TIRFM). Este método es particularmenteútil si la mayoría de los receptores están localizados en las regiones intracelulares, ya que TIRFM aumenta la visibilidad de la membrana plasmática. TIRFM también permite la resolución de la dinámica del tráfico de vesículas individuales que llevan receptores marcados SEP tras la inserción en el PM. La reflexión interna total se produce en la interfase de materiales con diferentes índices de refracción, como entre una célula y un cubre de vidrio ^{21, 22.} Septiembre emite fluorescencia cuando se irradia con 488 nm de excitación, que está orientada para alcanzar la reflexión interna total en la interfaz de la solución de vidrio y celular. Esto produce una onda evanescente que penetra aproximadamente 150 nm en la muestra, sólo fluoróforos emocionantes dentro de este volumen. Sólo septiembre que contiene los receptores en un entorno de pH neutro dentro de este rango de excitación son detectados, correspondientes a los que residen en la membrana plasmática o retículo endoplásmico periférica. Dado que la detección es t limitadoo la excitación por la onda evanescente, la fluorescencia de fondo de la región intracelular se reduce y la relación señal a ruido se aumenta ^{21, 22.} Además, ya que la radiación no penetra en la mayor parte de la célula, se minimiza el daño solar que permite imágenes de células vivas en el transcurso del tiempo. Como resultado, TIRFM acoplado con codificada genéticamente septiembre proporciona la requerida para la medición de localización subcelular y tráfico dinámica de los receptores de membrana a lo largo de la vía secretora de alta resolución y sensibilidad.

Protocol

1. Cultivo de células y transfección Mantener las células de neuroblastoma de ratón 2a (N2a) en medio de crecimiento. Hacer 500 ml de medio de crecimiento N2a de 200 ml de medio de Eagle de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa, 250 ml reducen medio de suero, 50 ml de suero fetal bovino (FBS), y 5 ml de penicilina / estreptomicina (100x). Mantener las células en un matraz T75 a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Dividir celdas 1:15 cua…

Representative Results

Septiembre incorporación en un receptor permite la detección directa de que el receptor en una célula viva. Junto con TIRFM, esto permite la evaluación de los niveles relativos de expresión en la membrana plasmática y la distribución de los receptores dentro de las ubicaciones subcelulares en la región de TIRF de excitación. eventos individuales tráfico de vesículas también pueden ser resueltos. Los niveles relativos …

Discussion

La sensibilidad al pH de la SEP permite receptores que residen en la membrana plasmática a distinguirse de los receptores intracelulares en el retículo endoplásmico, y se puede utilizar para resolver los eventos de inserción de receptor de transporte de vesículas ^{5, 7, 8, 9, 18, 19, 20}…

Materials

Reagent/Material
Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2	VWR	82050-856
35 mm glass bottom petri dishes, sterile	Cell E&G	GBD00002-200
Poly-D-lysine	vwr	215017510
Dulbecco Modified Eagle Medium‎ (DMEM), High Glucose	Fisher Scientific	11-965-084
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco / Fisher Scientific	31-985-088
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)	Gibco / Fisher Scientific	16-000-044
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Fisher Scientific	12604-021
Penicillin-Streptomycin Solution	VWR	45000-652
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Gibco / Fisher Scientific	21083027	Optional
Lipofectamine	Fisher Scientific	11668030	Gently mix; Do not vortex
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-10
Magnesium chloride	Fisher Scientific	BP214-500
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Objective immersion oil	Olympus	Type F
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Microscope	Olympus	IX81
Camera	Andor	iXon Ultra 897
60x, 1.49 NA oil immersion objective	Olympus	APON 60XOTIRF
Motorized stage	Prior	IXPROXY
Motorized actuator (stepper motor)	Thorlabs	ZST213
MetaMorph (or other imaging program)	Metamorph
488 nm laser	Market Tech
Single mode fiber	Thorlabs	SM450
Mirrors	Thorlabs	BB1-E01
Dichroic 488 nm LP	Semrock	Di02-R488-25×36
Bandpass filter, 488 nm	Semrock	LL01-488-12.5
Bandpass filter, 525/50	Semrock	FF03-525/50-25