Использование иммуногистохимического метода цельного монтирования для изучения иннервации билиарного тракта в<em> Солнце</em
Summary
Универсальный иммуногистохимический подход для визуализации экспрессии белка нейрофиламента в внепеченочном желчном тракте у Suncus murinus. Представлен здесь. Этот протокол может быть использован для анализа иннервации всех висцеральных органов у S. murinus или других видов.
Abstract
В этой работе подробно описывается метод полного окрашивания иммуногистохимическим методом, с использованием антител против нейрофиламентного белка для обозначения иннервации желчного тракта у Suncus murinus ( S. murinus ). Во-первых, образец рассекали из S. murinus и фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA). Во-вторых, проводилась ферментативная обработка и потенциальная эндогенная инактивация пероксидазы. Затем образец подвергали воздействию первичного антитела, антитела против нейрофиламентного белка, в течение 3-6 дней. Затем его инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена. Цветовая реакция была обнаружена путем взаимодействия образца с субстратом 3,3'-диаминобензидина (DAB). Этот метод может быть применен для анализа иннервации всех висцеральных органов. Кроме того, этот протокол также может быть адаптирован для тестирования других нейронных антител, но оптимизация антителДолжны быть выполнены в первую очередь. Этот метод был первоначально представлен Куратани и Танакой 1 , 2 , 3 .
Introduction
Домашний мускусник , Suncus murinus , принадлежит к ордену Insectivora и семье Soricidae. Это крошечное млекопитающее распространяется по всей Юго-Восточной Азии и обитает в домах и травянистых районах, которые расположены вблизи человеческих обитателей или скотков 4 . Этот вид имеет общие морфологические характеристики, более похожие на человека, чем у других лабораторных животных, таких как мышь, крыса и кролик 5 . Ранее для выявления периферических нервов в поджелудочной железе 6 , крупном дуоденальном сосочке 7 , пилорусе 8 , желчном пузыре 5 и экстрапекальном билиарном тракте 9 использовалось иммуноокрашивание с полным расположением с маркером периферических нейронов для белка нейрофиламента S. murinus (NFP).
NFP представляет собой макромолекулярный комплекс, который является частью зрелого нейронового цитоскелета. Нейрофиламент-связанный белокS посреднические взаимодействия между NFP и zygosome. Как ферментная функция, так и структура линкерных белков регулируются NFP 10 . Комплекс NFP состоит из трех полипептидов: NF-L (70 кДа), NF-M (150-160 кДа) и NF-H (200 кДа). NFP можно найти в нейронных аксонах как в центральной, так и в периферической нервной системе. Было показано, что анти-человеческое антитело NFP обозначает аксоны центральной и периферической нервной системы. Анатомические и электрофизиологические исследования показали, что сфинктер, желчный пузырь и проксимальный желудочно-кишечный тракт связаны с 11 , 12 , 13 , 14 . Однако морфологические особенности их нейронных соединений еще не определены.
Эта работа демонстрирует использование метода иммуногистохимического окрашивания с полным креплением для маркировки иннервации S. murinus bilIary с NFP-антителом.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой работе описывается экспериментальная процедура визуализации иннервации внепеченочного желчного тракта с использованием антитела против нейрофиламентного белка. Этот протокол был адаптирован из протокола, описанного Куратани и Танакой 1 , 2 ,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
У авторов нет подтверждений.
Materials
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
- Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
- Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
- Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
- Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
- Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
- Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
- Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
- Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
- Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).
