ओकुलर संचलन में लेबल वाले रक्त कोशिकाओं के लाइव-सेल इमेजिंग मधुमेह के रेटिनोपैथी और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन में सूजन और ischemia के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। रेटिनल परिसंचरण में लेबल वाले कोशिकाओं को रक्त कोशिकाओं और छवि को लेबल करने वाला एक प्रोटोकॉल वर्णित है।
रेटिनल और कोरॉयडल रक्त प्रवाह की गतिशीलता विभिन्न आक्सीलर बीमारियों के रोग विज्ञान और सिक्वेल में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती हैं, जैसे कि कांच का दर्द, मधुमेह, रेटिनोपैथी, उम्र से संबंधित मैकिलेटर अध: पतन (एएमडी) और अन्य ओकुलर भड़काऊ परिस्थितियां। यह आंखों में चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने में भी मदद कर सकता है। लेबल कोशिकाओं के लाइव-सेल इमेजिंग के साथ रक्त कोशिकाओं के उचित लेबलिंग, रेटिना और कोरोजल परिसंचरण में प्रवाह गतिशीलता की जांच के लिए अनुमति देता है। यहां, हम 1.5% इंडोकेनिन हरी (आईसीजी) और चूहों एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स के 1% सोडियम फ्लोरसेसेन लेबलिंग के मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। सी 57 बीएल / 6 जे चूहों (जंगली प्रकार) के रेटिना परिसंचरण में लेबल वाली कोशिकाओं को देखने के लिए स्कैनिंग लेजर ऑफ्थेल्मोस्कोपी (एसएलओ) लागू किया गया था। दोनों तरीकों ने माउस रेटिनल परिसंचरण में विशिष्ट फ्लोरोसेंटली लेबल वाले कोशिकाओं का प्रदर्शन किया। इन लेबलिंग विधियों में विभिन्न आंत्र रोगों में व्यापक अनुप्रयोग हो सकते हैंमॉडल के।
रेटिना और कोरोजल परिसंचरण में रक्त कोशिकाओं के प्रवाह की गतिशीलता का अध्ययन करना संभवतः दृष्टि-धमकी वाले नेत्र रोगों और अन्य ओकुलर भड़काऊ परिस्थितियों के रोगजनन को समझने के लिए आवश्यक है। हालांकि, परंपरागत एंजियोग्राफी तकनीकों, जिसमें प्लाज्मा प्रोटीन के लिए फ्लोरोसेंट डाईज की बाध्यकारी शामिल होती है, एरिथ्रोसाइट्स या लेकोसाइट 1 की गतिशीलता के बारे में कोई जानकारी प्रदान नहीं करती है। रेटिना में मेटाबोलिस्टिक कुशल परिसंचरण और एल्यूकोकाइट प्रवाह गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एरिथ्रोसाइट रेटिना प्रवाह गतिशीलता महत्वपूर्ण हैं, विभिन्न भड़काऊ परिस्थितियों में सेल प्रवासन, मान्यता, आसंजन और विनाश को समझने के लिए 2 । विभिन्न सेल प्रकार 3 की पहचान और लक्षण वर्णन में प्रयुक्त कई फ्लोरोसेंट अणु मौजूद हैं। रक्त कोशिकाओं के hemodynamics उन्हें उचित फ्लुर्स के साथ धुंधला करके मापा जा सकता हैसेंट डाइज और उचित इमेजिंग तकनीकों को लागू करना 4 ।
उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) और मधुमेह के रेटिनोपैथी (डीआर) जैसे इंटोकोक्युलर बीमारियों में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं की उपस्थिति में रोगग्रस्त क्षेत्र 5 , 6 में लिम्फोसाइटों का संग्रह शामिल है। ऊतकों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ट्रैक करने से रोग रोगजनन के तंत्र में शामिल जटिल घटनाओं को समझने में मदद मिल सकती है। 51 सीआर और 125 जैसे रेडियोधर्मी आइसोटोप को प्रारंभिक अध्ययनों में सेल ट्रैसर के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ये रंजक विषाक्त हैं और सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करते हैं। यद्यपि रेडियोधर्मी मार्करों 3 एच और 14 सी कम उत्सर्जन ऊर्जा के कारण, कोशिकाओं को कम विषैले होते हैं, सिस्टम 7 , 8 में अपने संकेतों का पता लगाना मुश्किल है। फ्लोराकोरम डाईज की एक संख्या को जुड़ी संभावित समस्याओं से उबरने के लिए पेश किया गया थारेडियोधर्मी मार्करों के साथ और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमैट्री 9 , 10 का उपयोग करके इन विट्रो में लिम्फोसाइट प्रवास को ट्रैक करें। Hoechst 33342 और थियाज़ोल नारंगी डीएनए बाध्यकारी फ्लोरोसेंट रंजक हैं, जो कि vivo में लिम्फोसाइट्स को ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जाता है । Hoechst 33342 डीएनए में एटी-समृद्ध क्षेत्रों में बांधता है, झिल्ली पारगम्य है, 2-4 दिनों के लिए फ्लोरोसेंट संकेतों को बरकरार रखता है और 9 , 10 शमन करने के लिए प्रतिरोधी है। होच्स्ट 33342 और थियाज़ोल नारंगी के नुकसान लिम्फोसाइट प्रसार 11 और शॉर्ट आधा जीवन, क्रमशः 9 का निषेध है।
कैलसेन-एएम, फ्लोरोसिसिन डायसिसेटेट (एफडीए), 2 ', 7'-बीआईएस- (2-कार्बोक्सीथाइल) -5- (और -6) -कारबॉक्साइफ्लोरेससेन, एसिटोॉक्सिमथिल एस्टर (बीसीईसीएफ-एएम), 5- (और -6) – कार्बोक्सीफ्लोरोरेससेन डायसिसेटेट (सीएफडीए), और 5- (और -6) -कारबॉक्साइफ्लोरेससेन डायसिसेट एसिटोक्सीमाइथाइल एस्टर (सीएफडीए-एएम)लिम्फोसाइट प्रवासन अध्ययनों के लिए उपयोग किया गया cytoplasmic फ्लोरोसेंट रंजक हैं। हालांकि, एफडीए, सीएफडीए और सीएफडीए-एएम कोशिकाओं 9 में कम प्रतिधारण हैं बीसीईसीएफ-एएम प्रजननशील प्रतिक्रिया को कम कर देता है और केमोटाक्सिस और सुपरऑक्साइड उत्पादन 9 , 12 को प्रभावित करता है। कैल्सेन-एएम एक फ्लोरोसेंट डाई है और विवो लिम्फोसाइट प्रवासन अध्ययन में अल्पावधि के लिए उपयोगी है। यह मजबूत फ्लोरोसेंट संकेतों का उत्सर्जन करता है, अधिकांश सेलुलर फ़ंक्शंस में हस्तक्षेप नहीं करता है और 3 दिन 12 , 13 तक फ्लोरोसेंट संकेतों को बरकरार रखता है। फ्लोरेससेन isothiocyanate (एफआईटीसी) और कार्बोक्सीफ्लोरेससेन्स डायैसिसेट सुक्किनिमिड एस्टर (सीएफडीए-एसई) सहसंयोजक युग्मन फ्लोरोसेंट रंजक हैं, जो लिम्फोसाइट प्रवासन अध्ययनों के लिए उपयोग किया जाता है। एफआईटीसी सेल व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं दर्शाती है और टी लिम्फोसाइटों 14 , 15 की तुलना में बी लिम्फोसाइटों के साथ मजबूत संबंध है </sup>। सीएफडीए-एसई लेबल लिम्फोसाइटों को 8 सप्ताह से अधिक तक और 8 सेल डिवीजन 9 , 16 तक के लिए विवो में ट्रैक किया जा सकता है। सी 18 डीआईआई (1,1'-डायोटेक्टेसीएल -3,3,3 ', 3'-टेट्रामिथिलंडोकार्बोकाइनाइन प्रक्लोरेट), डीआईओ (3,3 डीओएटीएडीसीडीसीएकोबोर्काइनाइन पेरक्लोरेनेट), पॉल कार्ल होरान (पीकेएच) 2, पीकेएच 3, और पीकेएच 26 झिल्ली- ल्यूकोसाइट्स और एरिथ्रोसाइट्स को लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट लाइपोफिलिक कार्बोकाइनाइन डाईज डालें। सी 18 दिल और डीआईओ उच्च संकेतों को पेश करते हैं जब कोशिका झिल्ली में शामिल होता है और अपेक्षाकृत गैर विषैले 12 , 17 है । पीकेएच 2, पीकेएच 3 और पीकेएच 26 लेबल वाले कोशिकाएं कम विषाक्तता 18 , 1 9 , 20 , 21 , 22 के साथ फ्लोरोसेंट संकेतों की अच्छी प्रतिधारण दर्शाती हैं। हालांकि, पीकेएच 2 नीचे CD62L अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है और ली को कम कर देता है माफ़ोसाइट व्यवहार्यता 23
लिम्फेटिक्स में लिम्फोसाइट प्रवासन और प्रसार पर नज़र रखने और गैर-ओकुलर परिसंचरण में लेबल एरिथ्रोसाइट्स का अध्ययन करने के लिए उपरोक्त वर्णित अधिकांश अध्ययन किए गए हैं। ओकुलर परिसंचरण में रक्त कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए लेबलिंग तकनीकों को लागू करने में बहुत कुछ अध्ययन हैं। स्कैनिंग लेजर ऑथेथोमॉस्कोपी (एसएलओ) के आवेदन को फुडस एंजियोग्राफी 24 द्वारा रेटिव और कोरोएडियल संचरण में लेबल वाले कोशिकाओं का अध्ययन करने में बहुत अच्छा फायदा है। कई फ्लोरोसेंट रंजक जैसे कि आईसीजी, एसी्रिडिन नारंगी, एफआईटीसी, सोडियम फ्लोरसेसेन और सीएफडीए हैं जो स्लो 25 , 26 , 27 , 28 , 2 9 , 30 , द्वारा रेटिना संचलन में ल्यूकोसाइट्स का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है ।वर्ग = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 एक्रुडीन नारंगी 26 , 27 की फोटोटोक्सिसिटी और कार्सिनोजेसिटीटी, सेलुलर गतिविधि के साथ एफआईटीसी के हस्तक्षेप और रेटिना और कोरॉयडल रक्त वाहिकाओं के संकल्प के लिए एक इंट्रावास्कुलर कंट्रास्ट एजेंट की आवश्यकताएं विवो पशु प्रयोगों में अपने आवेदन को सीमित करती हैं। सोडियम फ्लोरोसिसिन और आईसीजी गैर-विषैले हैं, जो कि खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा अनुमोदित है, और मानवों के परीक्षण के लिए सुरक्षित 32 , 35 अधिकांश प्रवाह गतिशील अध्ययन लियोकोसाइट्स या एरिथ्रोसाइट्स के लेबलिंग से संबंधित हैं और रेटिना और कोरॉयडल रक्त वाहिकाओं 36 , 37 , 38 , 3 9 में इसकी दृश्यता </s> ऊपर। यहां, हम एरिकथ्रोसाइट्स के आईसीजी लेबलिंग के एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, ल्यूकोसाइट्स के सोडियम फ्लोरेससेन लेबलिंग, और एसएलओ का उपयोग करके माउस रेटिना परिसंचरण में विज़ुअलाइज्ड लेबल वाली कोशिकाओं को ट्रैक करना।
रेटिना और कोरोज़डिकल परिसंचरण में हेमोडायनामिक्स का अध्ययन करना कई आंत्र रोगों के पैथोफिजियोलॉजी को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। रेटिनल परिसंचरण में रक्त प्रवाह की गतिशीलता का अध्ययन फूरियर-डोमेन ?…
The authors have nothing to disclose.
अनुसंधान परियोजना को नेशनल मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एनएमआरसी), सिंगापुर से न्यू इन्वेस्टीग्रेटर अनुदान के तहत वित्त पोषित किया गया था। टीम नेशनल मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एनएमआरसी) ओवरसीज रिसर्च ट्रेनिंग फैलोशिप के तहत नवंबर 2012 से अक्टूबर 2014 तक प्रोफेसर के मार्गदर्शन में डॉ। अग्रवाल इंस्टीट्यूट ऑफ ऑप्थल्मोलॉजी (आईओओ), यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन (यूसीएल) को प्रदान की गई अनुसंधान प्रशिक्षण को स्वीकार करना चाहूंगा। डेविड शिमा डा। शिमा के प्रयोगशाला में कोशिकाओं को लेबल करने और लाइव इमेजिंग के लिए डा। अग्रवाल ने अवधारणा और कौशल हासिल किए। इसलिए टीम प्रो। डेविड शिमा, प्रो.एफ. केनिथ मेइस्नर, डॉ। पीटर लुंड और डॉ। दयजू इवाता से प्रशिक्षण सहभागिता के दौरान पर्यवेक्षण और मार्गदर्शन को स्वीकार करना चाहेंगे।
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
Microcentrifuge tubes 2mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
Shaker incubator | Lab Tech | ||
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
Vidisic Gel 10G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |