Summary

Analyse af proteinkinaseaktivitet med radiomærket ATP

Published: May 26, 2017
doi:

Summary

Proteinkinaser er højt udviklede signalerende enzymer og stilladser, der er kritiske for inter- og intracellulær signaltransduktion. Vi præsenterer en protokol til måling af kinaseaktivitet ved brug af radioaktivt mærket adenosintrifosfat ([γ-32P] ATP), en pålidelig metode til at hjælpe med at tydeliggøre cellesignalregulering.

Abstract

Proteinkinaser er i stand til at styre storskala cellulære forandringer som reaktion på komplekse arrays af stimuli, og en stor indsats har været rettet mod at afdække allosteriske detaljer i deres regulering. Kinaser omfatter signaleringsnetværk, hvis defekter ofte er karakteristika for flere former for cancer og beslægtede sygdomme, hvilket gør en analyseplan til rådighed til manipulation af opstrøms regulatoriske faktorer og validering af reaktionskrav, der er kritiske i søgen efter forbedrede terapeutiske midler. Her beskriver vi et grundlæggende kinase-assay, der let kan tilpasses til specifikke eksperimentelle spørgsmål, herunder men ikke begrænset til testning af virkningerne af biokemiske og farmakologiske midler, genetiske manipulationer såsom mutation og deletion såvel som cellekulturbetingelser og behandlinger til sonde Celle signaleringsmekanismer. Dette assay udnytter radiomærkede [y-32P] ATP, som muliggør kvantitative sammenligninger og klar visualisering af resultater og kan modIfied til brug med immunopræcipiterede eller rekombinante kinaser, specifikke eller typiske substrater, over en lang række reaktionsbetingelser.

Introduction

Proteinkinaser er sofistikerede enzymer kritiske for transmissionen af ​​cellulære signaler i passende svar 1 . I betragtning af deres roller i at opretholde homeostase og forebyggelse eller fremme af sygdomstilstande 2 , er biokemiske metoder til vurdering af kinaseaktivitet fortsat effektive værktøjer til at afgrænse oplysningerne om eukaryotisk signalering 3 . Selvom strategier, der benytter phosphospecifikke antistoffer, har været meget informative med hensyn til måling af virkningerne af forskellige behandlingsbetingelser på celle signaleringsstatus 4 , tillader et kinaseassay at måle virkningerne af forskellige behandlingsbetingelser direkte i form af enzymatisk aktivitet af en kinase af interesse. Mens der er flere muligheder for lignende analyser, der ikke bruger radioaktive materialer 5 , fortsætter vi med at anvende denne metode til robust kvantificering af resultater. derEr to typiske anvendelser af dette assay, begge værdifulde af forskellige årsager: det immunpræcipiterede (IP) kinaseassay ( Figur 1 ) og det rekombinante proteinkinase assay ( Figur 2 ).

IP-kinaseassayet er yderst nyttigt til at identificere faktorer, der er i stand til at aktivere specifikke proteinkinaser såvel som måling af inhiberende behandlingsbetingelser. I korte træk transfekteres en epitop-mærket kinase af interesse i dyrkede eukaryote celler, udsættes for en række behandlinger, immunpræcipiteres og analyseres for evnen til at inkorporere radioaktivt mærket phosphat i et modelsubstrat ( fx myelinbasisk protein (MBP)). IP-kinaseassay kan også udføres uden at ty til overekspression, enten ved immunpræcipitation af endogent protein eller et hvilket som helst antal genom-redigeringsteknikker. Fordi behandlingerne administreres i kultur, kan denne metode detektere stimuleringer transmitteret gennem flere opstrømsfaktorerEller parallelle veje ved in vitro- aflæsning. En stor fordel ved denne metode er, at den ikke kræver forudgående kendskab til direkte opstrøms eller nedstrøms faktorer eller phosphoryleringssteder deri. Når specifikke substrater for en interessekinase er blevet identificeret, kan specifikke kinasassayprotokoller anvendes med rekombinante komponenter til måling af specifik aktivitet over for naturlige substrater og identifikation af specifikke phosphoryleringssteder, når de kombineres med massespektrometrianalyse. Sites identificeret på denne måde kan valideres yderligere med kinaseanalyser under anvendelse af substratmutanter. Endelig kan denne metode også bruges til at detektere og måle autophosphorylering.

Den heri tilvejebragte protokol antager enten et optimeret proteinrensningsskema eller transfektionsmetode til ekspression af en affinitetsmærket kinase af interesse i dyrkede celler. Til mere detaljerede udstillinger af transfektion, lysis, immunpræcipitation og proteinrensning protOcols, foreslår vi at henvise til Cold Spring Harbor Protocols 6 . For yderligere information om analyseudvikling og modifikation henvises til Proteinphosphorylation: Selected Methods in Enzymology 7 .

Protocol

1. Kinase Oprensningsressourcer og Generel Immun Udfældning Pipeline BEMÆRK: Kinaser til anvendelse med dette assay kan hidrøre fra immunpræcipitater af dyrkede celler eller ved rekombinante midler, såsom affinitetsmærket rensning 6 . Nedenfor er en generel protokol for flag-mærket immunpræcipitation, som muligvis skal modificeres afhængigt af kinasen af ​​interesse. Alt skal holdes på is når det er muligt. Tilsæt 2 μl 1 mg / ml antistof ti…

Representative Results

WNK1 IP kinase assays Myc-mærket WNK1 blev transficeret i HEK293-celler og immunpræcipiteret med et anti-Myc-antistof 11 . Immunpræcipitatet viste kinaseaktivitet over for modellsubstratet MBP såvel som mod sig selv ( Figur 1A ). WNK1-mutanter blev derefter testet for kinaseaktivitet mod MBP ved samme metode, denne gang ved anvendelse af GST-mærket konstruktioner ( figur 1B</s…

Discussion

Kinaser er en forskelligartet familie af proteiner, der har udviklet stor funktionalitet i mange sammenhænge, ​​og kinaseanalyser har været utroligt nyttige til at studere flere signalproteiner og har i høj grad bidraget til vores nuværende forståelse af cellulær kommunikation. Navnlig blev det samme basiske assay anvendt til karakterisering af to forskellige kinaser på trods af store forskelle i struktur og aktivitet. WNK1 kinase indeholder en atypisk katalytisk lomme, hvor den kritiske lysin har skiftet til…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker alle nuværende og tidligere medlemmer af Cobb laboratoriet for værdifuldt arbejde og diskussioner, og Dionne Ware til administrativ bistand. Disse undersøgelser blev støttet af National Institutes of Health Grant R37 DK34128 og Welch Foundation Grant I1243 til MHC

Materials

Protein A Sepharose CL-4B GE Healthcare Life Sciences 17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG035C010MC
Laemmli Buffer Bio-Rad #1610737
Radioactive shielding Research Products International BR-006
R-250 dye (Coomassie) Thermo Fisher 20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper Whatman 1003-917
Slab gel vacuum dryer Bio-Rad Model 583 Gel Dryer #1651745 
Autorad marker Agilent Technologies 420201
Phosphorescent ruler Sigma Aldrich R8133
Phosphorescent dots Sigma Aldrich L5149
Geiger counter Ludlum Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8×10" Carestream Health 107 2263
BioMax MS Film 8×10" Carestream Health 829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8×10" Carestream Health 851 8706
Medical/X-ray film processor Konica Minolta SRX-101A
Scintillation vials Research Products International 125500
Scintillation fluid MP Biomedicals 188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter Beckman LS 6500

References

  1. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
  2. Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).
  3. Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
  4. Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).
  5. Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).
  6. Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).
  7. . Autoradiography Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011)
  8. Walker, J. M. . The Protein Protocols Handbook. , (2009).
  9. Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).
  10. McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).
  11. Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).
  12. Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).
  13. Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).
check_url/55504?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. J. Vis. Exp. (123), e55504, doi:10.3791/55504 (2017).

View Video